HtrA對乳牙變異鏈球菌產酸、黏附的體外研究

王 玲，劉 瑤，韓林秀，劉興容

(西南醫科大學:1口頜面修復重建與再生實驗室，2附屬口腔醫院兒童口腔科,四川瀘州 646000；3四川省交通運輸廳公路局醫院口腔科)

乳牙齲是兒童最常見的口腔疾病，第四次全國口腔健康流行病學調查結果顯示5歲兒童乳牙齲患率為70.9%，其中經過充填治療的牙齒比例僅為4.1%[1]，可見我國兒童乳牙存在患齲率高而就診率低的狀況。多項研究[2-4]證實，兒童唾液中變異鏈球菌濃度與乳牙齲壞嚴重程度呈正相關性。其致齲性主要毒力因子包括：產酸耐酸能力、在牙面定植形成生物膜的能力、合成胞內及胞外多糖的能力等[5-6]。絲氨酸蛋白酶是變異鏈球菌的致齲關鍵酶，由HtrA基因編碼的HtrA蛋白作為一種熱休克蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶家族重要成員。前期實驗已篩選出的乳牙變異鏈球菌HtrA 高毒力株的致齲性高于其他臨床分離株[7]，同時利用分子生物學技術構建的HtrA 缺陷株的轉化力減低，進而使其毒力出現了下降[8]。本次研究目的擬在前期實驗基礎上，比較HtrA高毒力株與HtrA 缺陷株產酸能力、體外黏附能力的差異，為HtrA 基因對乳牙變異鏈球菌致齲性調控研究提供一定實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株

乳牙變異鏈球菌HtrA 高毒力株(前期課題組篩選完成)；乳牙變異鏈球菌HtrA 缺陷株（前期課題組構建完成）；變異鏈球菌國際標準株UA159（簡稱UA159標準株）（四川大學華西口腔醫學院國家級重點實驗室提供）。

1.1.2 主要試劑

BHI液體培養基、BHI固體培養基（北京Solarbio科技有限公司）、羥基磷灰石粉末（上海邁坤化工有限公司）、熒光染料2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(6)-carboxyfluorescein,acetoxymethyl Ester（BCECF/AM，上海碧云天生物技術有限公司）、NaOH粉末（四川西隴化工有限公司）。

1.1.3 主要儀器

超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）、熒光酶標儀、Thermo Multiskan Go全波長酶標儀（美國Thermo 賽默飛公司）、雷磁PHSH-3F 型精密酸度計（上海儀電科學儀器股份有限公司）、電熱恒溫鼓風干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細菌的復蘇、培養及鑒定

將凍存的乳牙變異鏈球菌HtrA 高毒力株和HtrA缺陷株復蘇，經革蘭染色形態學及生化鑒定為純培養后，分別接種BHI瓊脂培養基中，37 ℃恒溫厭氧培養48 h，挑取單菌落接種于BHI液體培養基中，37 ℃厭氧培養24 h 增菌，酶標儀調節菌液吸光度OD600=1.0，備用。

1.2.2 生長曲線測定

將HtrA 高毒力株和HtrA 缺陷株的菌液（OD600=1.0）與BHI 液體培養基分別按總體積比為5%:95%的比例加入試管內，每組18管，37 ℃厭氧培養16 h，期間每隔2 h從兩組中各取2管菌液放置于4 ℃冰箱保存，直至16 h。各樣本震蕩混勻后各取200 uL 加入96 孔板，每管樣本取2 次，酶標儀測OD600值并做好記錄。

1.2.3 產酸能力測定

將HtrA高毒力株和HtrA缺陷株的菌液（OD600=1.0）與pH4.5～7.0（0.5 為間隔）的BHI 液體培養基分別以體積比為1:10的比例接種，每組菌株相同pH設置三份，37 ℃厭氧培養48 h，3 000 r/min 離心15 min，移取上清液，酸度計測定上清液終末pH 值，取三組均值，計算ΔpH（初始pH-終末pH）。實驗重復兩次。

1.2.4 黏附能力測定

1.2.4.1 細菌懸液的標記

分別取500 μL 菌液（OD600=1.0）HtrA 高毒力株和HtrA缺陷株的菌液于試管中，再分別加入1.5 mL PBS 緩沖液和3 μL 熒光染料BCECF/AM，放入37 ℃恒溫厭氧培養2 h，進行熒光標記。標記完成后，3000 r/min 離心5 min，PBS 洗滌。將洗滌好的兩組細菌分別重懸于37 ℃的PBS緩沖液中，酶標儀調節菌液OD600=1.0，分裝于96孔板中，備用。

1.2.4.2 唾液包被的羥基磷灰石的制備

量取50 mg 羥基磷灰石粉末，懸浮于10 mL 0.2 mol/L的NaOH溶液中，處理10 min，超純水洗滌直到上清液pH接近7.0，靜置使粉末沉淀，小心吸棄上清液，沉淀放入烘箱60 ℃過夜干燥。收集同一健康志愿者進食4 h后的無刺激性唾液30 mL，12 000 r/min離心20 min，收集上清液，無菌微孔濾膜過濾除菌。按照羥基磷灰石粉末：唾液=1 mg：200 μL的比例混勻，37 ℃恒溫放置1 h，2000 r/min離心5 min，移除上清液，沉淀即包被完成的羥基磷灰石。

1.2.4.3 黏附實驗

在96 孔板中加入包被完成的羥基磷灰石粉末1 mg，標記后的菌株200 μL，混合均勻。其中HtrA高毒力株和HtrA 缺陷株各3 個孔。37 ℃恒溫厭氧培養30 min。小心吸棄上清液，PBS 緩沖液輕柔洗滌沉淀1 次，PBS 緩沖液使沉淀重新懸浮，熒光酶標儀分別測定兩組細菌熒光值，即為黏附菌的熒光值。將只加入羥基磷灰石粉末和PBS緩沖液的相應對照孔作為陰性對照，將未加入羥基磷灰石粉末，只含標記菌液的相應對照組熒光值作為總的熒光值。在熒光酶標儀上設置激發波長為485 nm、發射波長為535 nm，測定各孔的熒光值，以減去陰性對照后的值作為測定的熒光值。

黏附率公式如下：

細菌黏附率=（黏附細菌的熒光值-陰性對照熒光值）/（總的熒光值-陰性對照熒光值）×100%

1.3 統計分析

2 結果

2.1 生長曲線測定

兩組菌株革蘭氏染色油鏡下（×1 000）形態分別如圖1、2 所示。在非應激環境下，兩組菌株在0～4 h 的生長趨勢和生長速度基本一致（P＞0.05），在4 h 及以后，HtrA 高毒力株的菌液濃度均高于HtrA缺陷株，其差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖1 HtrA高毒力株（×1 000）

圖2 HtrA缺陷株（×1 000）

圖3 兩菌株生長曲線的比較

2.2 產酸能力測定

在pH 為6.5 和7.0 時，兩菌株均能產酸，產酸能力沒有明顯不同，其差異無統計學意義（P＞0.05）；在pH 值6.0、5.5、5.0 時，HtrA 缺陷株產酸能力弱于HtrA 高毒力株，其差異有統計學意義（P＜0.05）；在pH值4.5時，HtrA缺陷株和HtrA高毒力株的產酸能力均受到明顯抑制，幾乎不產酸，其差異不具統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.3 黏附實驗測定結果

變異鏈球菌HtrA 缺陷株在唾液包被的羥基磷灰石表面的黏附率顯著低于HtrA 高毒力株（P＜0.05），見圖4。

表1 不同pH值下HtrA缺陷株和HtrA高毒力株的產酸能力的比較（±s，n=6）

表1 不同pH值下HtrA缺陷株和HtrA高毒力株的產酸能力的比較（±s，n=6）

圖4 兩菌株在唾液包被的羥基磷灰石表面的黏附率的比較（P＜0.05）

2.4 熒光顯微鏡下兩菌株黏附觀察

如圖5、6 所示，A、D 分別為熒光顯微鏡下缺陷株和高毒力株在羥基磷灰石表面的黏附情況，B、E分別為普通光鏡下同一視野觀察，C、F 為熒光顯微鏡和普通光鏡觀察圖片合并的情況，可見HtrA缺陷株在羥基磷灰石粉末表面的黏附比例少于HtrA 高毒力株。

3 討論

在齲病病因學的研究中，大量證據表明細菌是齲病發生發展先決條件，而變異鏈球菌是口腔齲病中最重要的致齲菌，一直以來都是各國學者齲病防治研究的一個熱點。有研究[9-10]表明包括變異鏈球菌在內的多數鏈球菌中，HtrA基因位于染色體復制起始點附近，包含有與染色體復制和細菌增殖有關的DnaA 蛋白的結合位點。本實驗結果表明在非應激條件下，HtrA基因缺失對乳牙變異鏈球菌高毒力株增殖速度產生了一定影響。因此推測HtrA 基因缺失影響了乳牙高毒力變異鏈球菌染色體的復制過程從而影響了它的生長增殖速度。變異鏈球菌在長期進化過程中形成了多種途徑代謝碳水化合物產生乳酸等有機酸[11]，有機酸持續作用于牙釉質表面，導致牙釉質軟化脫礦。本次實驗結果顯示：在酸性環境下，HtrA基因缺失降低了乳牙高毒力株變異鏈球菌產酸能力。Biswas 等[9]的研究顯示HtrA 基因缺陷可能影響烯醇酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）的表達，這兩種酶都是與糖酵解有關的細胞外酶。由此可以推測，HtrA是通過影響糖酵解過程中相關的酶，從而影響了細菌產酸的能力。

變異鏈球菌對牙面的黏附是形成牙菌斑的前提和致齲的重要條件，主要包括蔗糖依耐性黏附和非蔗糖依耐性黏附兩種途徑[12]。致齲菌對牙面的蔗糖非依賴性黏附,實際上是細菌表面的黏結素與獲得性膜中受體成分的特異性結合[13]。致齲菌對牙面的蔗糖依耐性黏附與葡聚糖介導的細菌黏附和聚集相關，并且葡糖基轉移酶（glucosyltransferase，GTF）和葡聚糖結合蛋白（glucan binding protein，GBPs）是與該過程相關的主要蛋白。Ahn 等[14]的研究表明在變異鏈球菌中只存在一個HtrA基因，且其對變異鏈球菌生物膜形成起重要調控作用。GTF利用蔗糖合成具有黏性的非水溶性葡聚糖來介導變異鏈球菌蔗糖依耐性黏附，GTF 還可進入早期獲得性膜并合成葡聚糖，給GBPs 提供結合位點，直接影響變異鏈球菌的初始黏附過程[15]。李政等[16]研究表明變異鏈球菌HtrA缺陷株GTF的表達高于HtrA高毒力菌株，但是其生物學活性弱于HtrA高毒力菌株，推測HtrA基因可能不是簡單影響GTF 的產量，而是影響了GTF 向細菌表面的轉運，同時，HtrA 基因可能對GTF 等蛋白的折疊發揮調節作用。本研究中HtrA 缺陷株在唾液包被的羥基磷灰石表面的黏附率低于HtrA 高毒力株，原因可能是HtrA蛋白作為一種蛋白酶和分子伴侶，對蔗糖依耐性黏附途徑中GTFs 和GBPs 等重要蛋白的折疊和胞內向胞外轉運過程中起重要調節作用，HtrA 基因缺陷導致HtrA 蛋白表達異常，從而影響了變異鏈球菌的黏附能力。

4 結論

本研究表明HtrA 基因缺陷會影響乳牙變異鏈球菌的生長、產酸及黏附能力，但其具體影響機制還需進一步研究。