姜黃素激活PPAR-γ及對腦膠質瘤抑制作用研究

段 然

（北京大學國際醫院神經外科，北京 102206）

腦膠質瘤是顱內常見的惡性腫瘤，近年來其發病率呈現逐年升高的趨勢［1］。手術是治療腦膠質瘤的常用方法，然而由于腦膠質瘤惡性化程度較高、侵襲和浸潤能力較強，手術很難切除所有病灶。雖然放、化療可以有效控制腫瘤的生長，然而由于腦部解剖位置特殊，且有血腦屏障阻礙藥物向腦部的分布，因此其療效較差，患者生存期較短［2-3］。現代研究表明姜黃中的有效成分姜黃素具有良好的抗腫瘤作用，對結腸、肝臟、乳腺等多種腫瘤具有良好的抑制和殺傷作用［4］。本研究探討姜黃素對人腦膠質腫瘤細胞的體外抑制作用以及其可能的作用機制，以期為新型抑制劑的研發提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

姜黃素購自北京金路鴻生物技術有限公司，使用無水二甲基亞砜（DMSO）溶解，并配制成100mM儲備液，貯存于-20°C條件下。DMEM培養基購自Gibco公司，胎牛血清購Biochrom公司，XTT試劑{c；3，3'-［1-（苯氨酰基）-3，4-四氮唑］-二（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸鈉和吩嗪二甲酯硫酸鹽}、碘化丙啶以及PPAR-γ抑制劑GW9662購自Sigma公司。RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒購自浙江浙科儀器設備有限公司。PPAR-γ和基因PCR引物［5］為上游：5'-CTTGGGTCGGCCTCGAG-3'，下游：5'-CATTACGGAGAGATCCACGGA-3'；GADPH基因引物為上游：GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG，下游：ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA。引物由上海生工合成。

1.2 細胞培養

膠質瘤細胞系U251細胞株購自ATCC。培養基的選擇、傳代方法和時間以及培養條件根據按照ATCC網頁中的描述進行。培養基為含有10%胎牛血清和100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM培養基。培養箱溫度37°C，二氧化碳含量5%。使用0.25%胰酶-EDTA對細胞進行解離。

1.3 細胞活力測試

腫瘤細胞于實驗前一天種植于96孔板中，每孔5 000個（2.5×104個/mL，200μL），在37°C，二氧化碳含量5%的培養箱中培養24h后棄去原培養基。對照組和觀察組細胞分別培養于含有DMSO（0.1%）不同濃度姜黃素，以及姜黃素與GW9662混合物的DMEM培養基中（含有1%胎牛血清和100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素），分別培養24h、48h和72h。培養結束后，向各孔中加入XTT試劑，試劑用量以及反應時間按說明書選擇。培養約2h后，在450和650nm波長下測定每孔的吸光度A450和A650。細胞活力按照以下公式計算。

細胞活力（%）=處理組A450-處理組A650/（對照組A450-對照組A650）×100%

1.4 細胞周期分析

U251腫瘤細胞于實驗前1天種植于24孔板中，每孔300 000個（0.5 x 106個/mL，600μL），培養24h后棄去原培養液。對照組和觀察組細胞分別培養于含有DMSO（0.1%）不同濃度姜黃素，以及姜黃素與GW9662混合物的DMEM培養基中（含有1%胎牛血清和100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素），培養24h、48h和72h。培養結束后，細胞使用0.25%胰酶-EDTA解離，400g條件下離心10min，收集沉淀物。細胞沉淀用70%乙醇（-20°C）固定，并加入PI染色30min。染色結束后用磷酸鹽緩沖液清洗2次，并將細胞重懸于300μL磷酸鹽緩沖液中，并使用流式細胞儀進行檢測。處于不同細胞周期的細胞含量計算由Flowjo完成。

1.5 PPAR-γ基因表達的測定

U251腫瘤細胞于實驗前1天種植于24孔板中，每孔300 000個（0.5 x 106個/mL， 600μL），培養24h后棄去原培養液。對照組和觀察組細胞分別培養于含有DMSO（0.1%）不同濃度姜黃素，以及姜黃素與GW9662混合物的DMEM培養基中（含有1%胎牛血清和100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素），培養8h。培養結束后細胞用0.25%胰酶-EDTA解離，并用PBS清洗一次。隨后使用Trizol法提取總RNA，逆轉錄成為cDNA。最后加入引物，并使用rt-qPCR對PPAR-γ基因表達進行定量。操作按照試劑盒的說明進行。

1.6 統計學分析

數據使用Microsoft Excel 進行整理，并用SPSS 19.0統計軟件處理分析。計量資料以（±s）表示，實驗數據來源于至少3次獨立重復試驗。多個樣本的比較使用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行，并用Tukey檢驗比較各組間差異的顯著性，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 姜黃素對U251細胞活力的影響

不同濃度姜黃素對U251細胞活力的影響見表1至表3。結果表明姜黃素對U251細胞活力的影響呈現劑量和時間依賴性。同時，檢測了PPAR-γ抑制劑GW9662對U251細胞活力的影響，結果表明GW9662本身對于U251細胞的活力沒有影響，給藥24、48和72h后U251細胞的活力與對照組相似，差異無統計學意義（P＞0.05）。然而，GW9662 可以顯著減弱姜黃素對U251細胞的抑制能力，接受兩種藥物共同處理的細胞活力較單獨使用姜黃素組明顯提高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 姜黃素和GW9662培養24h對U251細胞活力的影響 （%，±s）

表1 姜黃素和GW9662培養24h對U251細胞活力的影響 （%，±s）

分組 細胞活力 t（與對照組比較）P（與對照組比較）對照組 100.0 0± 0.00姜黃素 1μM 94.04 ± 1.94 3.05 0.373姜黃素 3μM 91.96 ± 1.67 4.12 0.119姜黃素 10μM 87.50 ± 2.60 6.41 0.007姜黃素 30μM 72.64 ± 1.53 14.03 ＜0.001 GW9662 10μM 97.03 ± 0.60 1.52 0.925姜黃素 30μM + GW9662 10μM 83.98 ± 3.26 8.21 ＜0.001

表2 姜黃素和GW9662培養48h對U251細胞活力的影響 （%，±s）

表2 姜黃素和GW9662培養48h對U251細胞活力的影響 （%，±s）

P（與對照組比較）對照組 100.00±0.00姜黃素 1μM 91.11±2.67 4.27 0.100姜黃素 3μM 89.67±2.83 4.96 0.042姜黃素 10μM 80.85±1.94 9.20 ＜0.001姜黃素 30μM 41.74±2.42 29.87 ＜0.001 GW9662 10μM 97.86±1.21 1.03 0.988姜黃素 30μM + GW9662 10μM 75.92±0.64 11.570 ＜0.001分組 細胞活力 t（與對照組比較）

表3 姜黃素和GW9662培養72h對U251細胞活力的影響 （%，±s）

表3 姜黃素和GW9662培養72h對U251細胞活力的影響 （%，±s）

P（與對照組比較）對照組 100.0±0.00姜黃素 1μM 93.27±2.31 3.15 0.339姜黃素 3μM 84.62±2.92 7.21 0.003姜黃素 10μM 74.03±2.04 12.17 ＜0.001姜黃素 30μM 46.14±2.15 25.24 ＜0.001 GW9662 10μM 98.32±1.37 0.78 0.997姜黃素 30μM + GW9662 10μM 63.60±2.71 17.06 ＜0.001分組 細胞活力 t（與對照組比較）

2.2 姜黃素對U251細胞周期分布的影響

姜黃素引起的細胞凋亡和細胞周期分布見表4至表6。結果表明姜黃素可以誘導Sub-G0期細胞的相對含量，且其誘導細胞凋亡的作用呈現時間依賴性。分析細胞周期的分布后，姜黃素主要引起細胞G0/G1期細胞周期阻滯，且作用呈現時間依賴性。在藥物作用的24～72h內，PPAR-γ抑制劑GW9662對U251細胞Sub-G0期的含量以及G0/G1期分布沒有明顯影響，差異無統計學意義（P＞0.05）。GW9662可以顯著降低姜黃素對U251細胞凋亡的誘導，明顯減少位于Sub-G0期細胞的含量（P＜0.05）。同時GW9662可以逆轉姜黃素引起的G0/G1期細胞周期阻滯，明顯降低G0/G1期細胞的含量，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表4 姜黃素以及GW9662培養24h對U251細胞周期的影響 （%，±s）

表4 姜黃素以及GW9662培養24h對U251細胞周期的影響 （%，±s）

注：與對照組比較，△P＜0.05。

分組 Sub-G0 G0/G1 S G2/M對照組 7.19 ± 1.45 34.21 ± 1.54 26.92 ± 3.75 34.33 ± 2.41姜黃素 30μM 25.03 ± 2.62△ 53.73 ± 1.06△ 9.75 ± 2.31△ 38.52 ± 2.23 GW9662 10μM 6.43 ± 1.38 34.37 ± 0.46 29.69 ± 1.28 36.52 ± 2.56姜黃素 30μM +GW9662 10μM14.04 ± 0.81△ 44.12 ± 1.76△ 13.18 ± 0.91△ 35.68 ± 1.17

表5 姜黃素以及GW9662培養48h對U251細胞周期的影響 （%，±s）

表5 姜黃素以及GW9662培養48h對U251細胞周期的影響 （%，±s）

注：與對照組比較，△P＜0.05。

分組 Sub-G0 G0/G1 S G2/M對照組 4.72 ± 1.08 33.87 ± 1.35 30.9 ± 0.7 32.54 ± 2.08姜黃素 30μM 32.76 ± 2.85△45.73 ± 2.36△6.32 ± 2.63△ 19.61 ± 1.02 GW9662 10μM 7.24 ± 1.25 30.81 ± 1.88 31.57 ± 2.39 31.38 ± 1.58姜黃素 30μM +GW9662 10μM22.93 ± 0.83△42.89 ± 1.8△ 11.17 ± 0.79△35.38 ± 0.71

表6 姜黃素以及GW9662培養72h對U251細胞周期的影響 （%，±s）

表6 姜黃素以及GW9662培養72h對U251細胞周期的影響 （%，±s）

注：與對照組比較，△P＜0.05。

分組 Sub-G0 G0/G1 S G2/M對照組 4.94 ± 1.46 35.85 ± 1.6 31.44 ± 3.56 37.88 ± 2.74姜黃素 30μM 40.08 ± 2.99△43.65 ± 1.23△9.22 ± 1.92△ 24.62 ± 1.20 GW9662 10μM 4.76 ± 0.17 35.66 ± 1.83 30.84 ± 1.09 36.19 ± 1.99姜黃素 30μM +GW9662 10μM22.78 ± 0.25△ 34.92 ± 1.31 12.96 ± 0.81△ 36.34 ± 1.19

2.3 姜黃素對PPAR-γ基因轉錄的影響

姜黃素對PPAR-γ基因轉錄的影響見表7。姜黃素可以提高PPAR-γ基因的表達，并呈現劑量依賴性。低劑量組（10μM）可以提高PPAR-γ基因的轉錄水平，但差異無統計學意義（P＞0.05）。GW9662對PPAR-γ基因的轉錄不產生明顯影響，但可以顯著降低姜黃素引起的PPAR-γ基因轉錄升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表7 姜黃素對PPAR-γ基因轉錄的影響 （倍，±s）

表7 姜黃素對PPAR-γ基因轉錄的影響 （倍，±s）

P（與對照組比較）對照組 1.00±0.00姜黃素 10μM 1.21±0.06 3.500 0.149姜黃素 30μM 1.40±0.08 6.667 0.002 GW9662 10μM 0.99±0.08 0.167 1.000姜黃素 30μM+GW9662 10μM 1.14±0.04 2.333 0.491分組t（與對照組比較）mRNA轉錄PPAR-γ/GADPH（倍數）

3 討 論

過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）是一類配體激活型核受體，其活性與腫瘤細胞的生長、凋亡以及腫瘤細胞微環境的變化有密切聯系。體外研究表明，PPAR-γ受體在包括乳腺癌、肺癌、腸癌、肝癌以及腦膠質細胞瘤的多種腫瘤細胞中均有表達［6-8］；在U251腫瘤細胞中，由于miR-130b高表達等因素的作用，PPAR-γ呈現低表達狀態；提高PPAR-γ的表達可以有效降低腫瘤的增殖和生長，加速腫瘤凋亡［9-10］。與提高其表達相似，通過藥物激活腫瘤細胞中的PPAR-γ受體也可以有效抑制細胞增殖、從而抑制腫瘤的生長和侵襲。具體機制包括以下幾類：激活PPAR-γ可以抑制細胞周期蛋白激酶Cdk4的活性，提高對Cdk4活性具有抑制作用的其他蛋白，例如p19、p21以及p27的表達，影響細胞的分裂過程［11］；其次，激活PPAR-γ可以降低抗凋亡相關蛋白Bcl-2的含量，提高凋亡相關酶類Caspase-3 和 Caspase-7的活化，又到細胞凋亡［12］。此外，激活PPAR-γ可以降低COX-2、VEFG以及炎癥因子的表達，抑制腫瘤誘導的血管新生，并誘導細胞分化，從而抑制腫瘤的進展［13］。

姜黃素是莪術的主要有效成分之一，體外研究表明對多種腫瘤細胞有良好的抑制作用。研究結果表明，姜黃素的體外抗腫瘤作用與激活PPAR-γ有關。在姜黃素的作用下，U251細胞中PPAR-γ基因表達明顯提高；細胞周期分析表明大多數細胞位于sub-G0期以及G0/G1期，其形成原因可能與姜黃素誘導細胞凋亡以及抑制Cdk4活性有關。上述研究結果與已有的文獻報道一致。為了進一步證明其作用靶點位于PPAR-γ，用特異性抑制劑GW9662與姜黃素共同處理細胞，結果表明姜黃素對U251細胞的殺傷作用、誘導細胞凋亡的作用以及提高PPAR-γ表達的作用均明顯減弱。以上結果進一步確認PPAR-γ與姜黃素對U251細胞的生長抑制作用有關。值得注意的是，在GW9662存在的條件下，姜黃素依然具有一定的體外抗腫瘤活性，推測其抗腫瘤作用還可能還存在其他機制。根據其化學結構與ATP的相似性，推測其作用靶標可能還包括激酶等，需要進行進一步研究。

綜上所述，實驗結果表明姜黃素可以提高膠質瘤U251細胞PPAR-γ的轉錄，誘導細胞凋亡以及G0/G1期細胞周期阻滯，其對腫瘤細胞生長的抑制作用于激活PPAR-γ有關。