加味神術散霧化對FM1感染小鼠NLRP3炎癥小體及下游炎性因子表達的影響

李繼庭，梁虹宇，蘇立芬

（1.廣東省第二中醫院，廣東 廣州 510095；2. 廣東省廣州市白云區人民醫院，廣東 廣州 510500）

流行性感冒是由流感病毒誘發的急性呼吸系統傳染性疾病，臨床采取流感疫苗僅能預防某些特異性病毒，但無法阻止病毒的不斷變異［1］。中藥霧化吸入具有芳香辟穢、直祛病邪、經絡傳導以及固護正氣等功效［2］。本研究用治療瘟病的經典方藥神術散經加味后制為霧化劑進行實驗，探究加味神術散霧化對FM1感染小鼠NLRP3炎癥小體及下游炎性因子表達的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

藥品。加味神術散（蒼術、白芷、甘草、金銀花、野菊花、羌活、藿香、冰片），購自廣東省第二中醫院。取15劑水煮蒸餾，濃縮后獲得黃色精油，采用乙醚將油反復溶出，加無水Na2SO4脫水干燥，用維持液將藥物混懸并超聲以備用。利巴韋林噴霧劑（史達德藥業有限公司，生產批號20171120）。

病毒毒種。甲1型流感病毒FM1鼠肺適應株，由廣州中醫藥大學熱研所病毒室提供。病毒經小鼠增強毒力后，于雞胚尿囊腔常規傳代培養2次，分裝，-70℃保存備用。

儀器和試劑。電子天平，F A 2 0 0 4 N購自上海精密儀器科學有限公司；全自動真空組織脫水機，LeicaASP300S，德國Leica公司；超凈工作臺，型號SB-7C-1B，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；高壓蒸汽滅菌器，型號YX280A，上海三申醫療器械有限公司；Shandon包埋機、Shandon手動切片機、Shandon全自動染色機，英國Shandon公司；倒置顯微鏡，BX-50，日本OLYMPUS公司；超低溫冰箱，ThermoForma，美國電熱集團（ThermoElectronCorporation）；電熱恒溫水浴鍋，DK-S22，上海精宏實驗設備有限公司；酶標儀，powerwave340，美國Bio-tek公司；高速勻漿機，IKAT10basicS25，德國IKA公司；隔水電熱恒溫培養箱，PYX-DHS-SOX，上海躍進醫療器械廠；高速冷凍離心機，HERMLE-z323k，德國HERMLE公司；TaKaRa試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司；R&DELISA試劑盒，廈門研科生物技術有限公司；麻醉缸、電子稱、眼科剪、鑷子、玻璃瓶、燒杯、燒瓶。一次性注射器、移液器吸頭等由廣州中醫藥大學實驗室提供。

1.2 動物

實驗小鼠的選擇和喂養。SPF級NIH小鼠80只，體質量13～15g，雌雄各半，小鼠由廣州弗爾博生物科技有限公司提供［貨號J022，醫動字第28-2023號，合格證編號SCXK（京）2018-0011］。分籠飼養，小鼠使用的籠具、飼料及墊料等均高壓消毒，喂養自來水和標準實驗小鼠飼料，能夠正常自由飲食飲水，白天光照時間和黑暗時間各12h。小鼠應用物品每隔3日進行消毒，適應性喂養7日。鼠房內備有空調以及排氣扇，實驗室溫度維持（23±1）℃，相對濕度（75±10）%，飼養過程達到SPF級標準。

2 實驗方法

模型復制［3］。進行感染小鼠造模，在麻醉缸內，用乙醚將小鼠輕度麻醉，正常對照組予以50mL0.9%生理鹽水滴鼻，其余各組均予以流感病毒稀釋液50mL滴鼻以感染小鼠造模。

分組和給藥。NIH小鼠采用隨機數字分配法分為正常組、利巴韋林組、病毒對照組、神術散霧化組共4組，每組20只。給藥劑量按動物每公斤體質量占人體表面積的比值計算。利巴韋林組予以利巴韋林0.13g/（kg·d），神術散霧化組予以加味神術散1.50g/（kg·d），正常對照組以及病毒對照組應用與神術散霧化劑組體積相同的0.9%生理鹽水。造模前2日給藥，給藥第3日在病毒接種1h后繼續給藥。將各組藥物原液稀釋成所需濃度，各組小鼠經咽部噴霧，連續給藥7日。每日喂養全價飼料，自由飲水。

3 觀察指標

咽部黏膜勻漿制作方法。滴鼻病毒感染后第5日，末次給藥24h后采取脫椎處死小鼠。其中每組10只獲得咽部黏膜，PCR樣品保存液保存，用于實時熒光定量PCR檢測；另外每組10只取咽部黏膜于低溫條件下，根據常規方法制備黏膜勻漿［黏膜重（g）/生理鹽水（mL）=1/9］，采取4℃2500r/min離心30min后獲取上清液，放-20℃冰箱中保存，以待ELISA檢測應用。

熒光定量P C R檢測咽部黏膜組織中N L R P 3、caspase-1的mRNA表達。采用TRIzol裂解獲得咽部黏膜組織，經氯仿抽提→異丙醇沉淀→75%乙醇洗滌→DEPC水溶解→分光光度計測定RNA含量以及純度處理。cDNA合成以及均參考TaKaRa試劑盒說明書進行，引物序列和反應條件。

IL-1β、IL-18水平檢測。采用R&DELISA試劑盒對咽部黏膜勻漿IL-1β、IL-18水平進行檢測，嚴格按說明書進行。

統計學方法。采用 SPSS19.0 統計軟件進行統計學分析，計量資料以（±s）表示、用t檢驗，計數資料以（%）表示、用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

4 治療結果

4.1 各組咽部黏膜NLRP3、caspase-1的mRNA相對表達量比較

與正常對照組比較，病毒對照組、利巴韋林組及神術散霧化組NLRP3、caspase-1的mRNA相對表達量較高（P＜0.05）；與病毒對照組比較，利巴韋林組及神術散霧化組NLRP3、caspase-1的mRNA相對表達量較低（P＜0.05）；與利巴韋林組比較，神術散霧化組NLRP3、caspase-1的mRNA相對表達量較低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組咽部黏膜NLRP3、caspase-1的mRNA相對表達量比較 （±s）

表1 各組咽部黏膜NLRP3、caspase-1的mRNA相對表達量比較 （±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與病毒對照組比較，#P＜0.05；與利巴韋林組比較，△P＜0.05.

images/BZ_7_1287_358_2253_422.png正常對照組 20 1.01±0.14 1.00±0.06病毒對照組 20 2.58±0.21* 2.94±0.42*利巴韋林組 20 1.22±0.13*# 1.36±0.18*#神術散霧化組 20 1.11±0.10*#△ 1.11±0.07*#△

4.2 加味神術散霧化對咽部黏膜勻漿IL-1β、IL-18的水平影響

與正常對照組比較，病毒對照組、利巴韋林組及神術散霧化組IL-1β、IL-18水平較高（P＜0.05）；與病毒對照組比較，利巴韋林組及神術散霧化組IL-1β、IL-18水平較低（P＜0.05）；與利巴韋林組比較，神術散霧化組IL-1β、IL-18水平較低（P＜0.05）。見表2。

表2 加味神術散霧化對咽部黏膜勻漿IL-1β、IL-18分泌水平的影響 （pg/mL，±s）

表2 加味神術散霧化對咽部黏膜勻漿IL-1β、IL-18分泌水平的影響 （pg/mL，±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與病毒對照組比較，#P＜0.05；與利巴韋林組比較，△P＜0.05.

images/BZ_7_1287_1189_2254_1261.png正常對照組 20 20.29±2.12 36.67±2.49病毒對照組 20 55.30±5.73* 94.21±5.18*利巴韋林組 20 36.29±3.89*# 71.70±5.01*#神術散霧化組 20 25.40±2.85*#△ 63.50±4.09*#△

5 討 論

中醫治療流感的有效性在臨床和實驗研究中獲得證實［4］，中醫的“內病外治”法歷史悠久，是中醫不可或缺的部分。隨著當今醫療模式的轉變和“以人為本”醫療理念的深化，中醫外治法因其便捷、有效以及安全等優勢受到廣大醫療學者的重視，近幾年中醫外治法逐步在臨床疫病防治中推廣。神術散出自《楊氏家藏方》，收錄于《太平惠民和劑局方》，用于治療四時瘟疫，頭痛項強，發熱憎寒，身體疼痛及傷風鼻塞，是瘟病犯衛的經典方。本研究在原方基礎上加入金銀花、野菊花以及冰片（蒼術、羌活、金銀花、白芷、藿香、野菊花、冰片、甘草）。方中蒼術燥濕健脾、祛風散寒、明目，白芷、羌活疏風散寒、散寒燥濕，藿香理氣和中、辛溫散寒，金銀花、野菊花清熱解毒，冰片透內熱、散郁火、避穢化濁，甘草調和諸藥。諸藥合用，可避穢化濁、透邪外出，發揮良好的疫病防治作用［5］。

NLRP3炎性小體由NLRP3、Caspase-1及銜接分子凋亡相關點樣蛋白（ASC）結合構成。正常機體NLRP3活性處于抑制狀態，在NLRP3配體和NLRP3的LRR相結合后促進熱休克蛋白分泌，NLRP3的NOD結構域存在自身寡聚化，致使其熱蛋白結構域（PYD）與ASC結合，并通過ASC的胱天蛋白酶招募結構域招募并激活Caspase-1，IL-1β、IL-18為Caspase-1的下游炎性因子，Caspase-1活化后使IL-1β、IL-18前體加工為成熟且有活性的形式，分泌于細胞外產生免疫作用。研究認為，NLRP3能感知胞內病原微生物和代謝物，是啟動和構成炎性復合體的重要成分［6］。Caspase-1是IL-1β、IL-18成熟有活性的轉化酶，是NLRP3炎性小體的效應蛋白。研究顯示，FM1感染小鼠的NLRP3及Caspase-1的表達量及其下游炎性因子IL-1β、IL-18存在顯著意義，上述因子水平均遠高于正常對照組小鼠，并發現NLRP3炎性小體在FM1感染的發生發展中具有重要作用［7］。研究結果顯示，神術散霧化組NLRP3、caspase-1的mRNA相對表達量、IL-1β、IL-18遠低于病毒對照組、利巴韋林組，提示加味神術散霧化可能通過下調NLRP3炎癥小體及下游炎性因子表達。

加味神術散霧化能下調NLRP3炎性小體及其下游因子IL-1β、IL-18的分泌水平，對流感病毒FM1感染小鼠具有免疫保護作用。從分子生物學水平分析其抗流感病毒的有效性，為加味神術散霧化治療流感的臨床應用提供了理論支持。