眼點擬微綠球藻養殖過程中致死細菌的分離鑒定與治理

趙鄢鵬,蔡忠貞,王 冰,耿金峰,白雪梅

(新奧集團 新繹健康科技有限公司,河北 廊坊 065001)

藻類是海洋系統中最初級的、最重要的生產者。其種類繁多,它合成的物質量約占全部光合作用合成生物量的1/3。藻類是具有極大應用價值的生物資源,富含對人體有益的、具有重要生理作用和保健功能的長鏈多不飽和脂肪酸,可用于天然食品、生物肥料、生物餌料等方面,具有重要的社會價值和經濟價值[1-3]。

目前國內外很多高校和科研機構都在對微藻進行著深入的、系統的研究[4]。在養殖條件穩定的情況下,微藻的產量較高,例如： Zhang等在日本的北方地區,夏季利用1.5 cm板式反應器培養集胞藻,在試驗控溫的情況下單位面積產量可達39.0 g/(m2·d)[5];據Moheimani等報道，顆石藻養殖的產量水平達16.0～33.5 g/(m2·d)[6]。但微藻企業在實際戶外養殖中的產量均不高,一般在5～10 g/(m2·d)。究其原因，除了受自然天氣、環境溫度的影響外,還有一個非常重要的原因是敵害生物污染問題。微藻養殖過程如果受到嚴重的敵害生物污染,那么可能會出現養殖顆粒無收的嚴重后果[7]。因此,在微藻養殖過程中敵害生物污染嚴重制約著微藻產量的提升,以及規模化的進程。國內外的科學家對污染的關注度也是越來越高,微藻養殖過程的污染按照物種不同可分為原生動物污染和細菌污染,其中對原生動物污染目前研究成果顯著,例如叢立晶等利用酸化法、堿化法等對藻液中的纖毛蟲、游捕蟲進行治理[8];吳松使用表面活性劑、漂白粉對原生動物進行滅殺[9];規模化養殖上常用的方法還有碳酸銨鹽法等[7,10]。微藻敵害生物污染的另一類是細菌污染,其細菌種類繁多,而細菌和微藻是一個共生體[11-14],有些細菌對微藻生長有促進作用,而有些細菌對微藻生長有抑制作用[15-17],甚至有些細菌具有溶藻的特性[18-20],可以導致藻細胞較快死亡,嚴重時將導致養殖失敗。例如朱曉漫等篩選到一種可以溶解銅綠微囊藻的細菌,經分子鑒定為蠟狀芽孢桿菌,后續可以將其開發成生物控藻菌劑[19];郗建云等對張俊篩選到的海桿菌屬細菌的溶藻特性進行了研究,該細菌對錐狀斯氏藻有顯著的溶藻作用,但對蛋白核小球藻與四尾柵藻無溶藻作用[20]。針對目前產業化藻株之一的眼點擬微綠球藻,其細菌污染治理方面的報道很少,尤其是在致死細菌的分離鑒定方面未見報道。但眼點擬微綠球藻的細菌污染問題同樣是制約其穩定養殖、產量提高、規模化進程的一個關鍵因素。因此,我們以本公司戶外養殖過程中出現的由于細菌污染而快速死亡的眼點擬微綠球藻藻液為研究對象,通過平板劃線法和高通量篩選技術分離了導致藻細胞死亡的細菌，通過16S rDNA全長序列擴增及測序等技術鑒定了致死細菌的屬、種,并研究了該致死細菌的有效殺滅方法,旨在為眼點擬微綠球藻的戶外穩定養殖提供有效的細菌污染治理方法,促進微藻規模化養殖進程。

1 材料與方法

1.1 材料

硫酸慶大霉素(以下簡稱為慶大霉素),購自煙臺只楚藥業有限公司，為1 kg獨立包裝,規格為10億/桶。將慶大霉素配制成1 g/L的母液后,根據需要進行稀釋(母液經0.22 μm濾膜除菌,稀釋操作全過程在無菌條件下進行)。本研究所用的其它試劑均為常規分析純試劑。EXTaq酶、dNTP、MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction kit購自TaKaRa公司;序列由Sangon公司測定;引物由Sangon公司合成。

1.2 主要儀器

分光光度計,日本島津UV-2550型。高通量篩選平臺,上海定制HYG-CTCYQ。PCR儀, BIO-RAD T100Thermal cycler, USA。

1.3 藻種與培養

眼點擬微綠球藻(Nannochloropsisoculata),由ENN生物質能源技術中心藻種質庫提供。所有實驗培養基均采用f/2海水培養基[8],鹽度為(3.3±0.1)%。實驗采用批次培養的方式進行。

細菌污染的藻液,簡稱污染藻液(下同):來自眼點擬微綠球藻的戶外培養過程,細菌數量在106個/mL數量級以上。

1.4 實驗方法

1.4.1 接種密度 利用藻液進行的各實驗組的接種細胞密度在0.8～0.9 g/L之間,主要以各實驗組相同體積下具有相同的生物質量為原則。

1.4.2 實驗用反應器規格 為內徑5 cm、高度80 cm的玻璃柱式(管式)反應器,一側密封，另一側開口。

1.4.3 致死細菌的分離和培養

1.4.3.1 細菌單菌落的分離和二次培養 將在戶外養殖過程中存在細菌污染的藻細胞液稀釋10倍,利用平板涂布法進行細菌單菌落的分離;對所得到的單菌落進行二次培養,最終獲得多株單菌落的細菌細胞。

1.4.3.2 單菌落細菌的液體培養 利用高通量篩選平臺,將單菌落細胞加入到5 mL的24孔板中(高通量篩選平臺專用),在31 ℃下以140 r/min的轉速培養24 h。

1.4.3.3 致死細菌的確定 利用高通量篩選平臺,將活化后的細菌液5 mL加入到裝有30 mL藻液的100 mL三角瓶中,在25 ℃下以140 r/min培養,加30 μE的人工光源,根據藻細胞的死亡情況最終確定致死細菌編號。

1.4.4 致死細菌的鑒定

1.4.4.1 細菌基因組DNA的提取 使用MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction kit提取基因組DNA。

1.4.4.2 細菌16S rDNA全長序列擴增及測序 參照Bosshard的方法。16S rDNA通用引物序列如下:8f， 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。25 μL PCR反應體系包括2.5 μL的10×PCR反應緩沖液、1 μL dNTP (2.5 mmol each)、1 U Taq酶、10 μmol的上、下游引物各0.5 μL、DNA模板約50 ng。PCR反應條件:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 80 s,共30個循環;72 ℃延伸5 min。PCR產物送交Sangon公司測序。

1.4.4.3 致死細菌屬、種的確定 根據測序結果,通過NCBI比對,確定致死細菌的屬、種。

1.4.5 致死細菌治理方法的研究 將獲得的致死細菌進行純培養,培養條件為37 ℃、120 r/min轉速、f/2+LB培養基。將經活化15 h的細菌液5 mL加入到100 mL的三角瓶中,再加入30 mL的f/2培養基，即為獲得的細菌培養液。

向次氯酸鈉組的細菌培養液中分別添加0.015、0.030 g/L的細菌治理試劑次氯酸鈉溶液；向慶大霉素組的細菌培養液中分別添加0.050、0.200 g/L的細菌治理試劑慶大霉素溶液；CK 1組(受到污染的藻液)不添加細菌治理試劑。對各組的細菌培養液在31 ℃條件下以140 r/min的轉速在培養箱內培養,8 h和24 h后各測定1次OD750。同時根據需要不定時地取樣涂平板,觀測細菌情況。每組設3個平行樣。

1.4.6 細菌治理效果的驗證 將受到細菌污染的藻液裝入玻璃柱式反應器中,每個反應器的裝液量為800 mL；向實驗1組、實驗2組和實驗3組加入細菌治理試劑次氯酸鈉溶液,使有效氯的濃度分別達到0.015、0.020、0.030 g/L; CK 1和CK 2(無污染的藻液)組均不添加細菌治理試劑。在操作時，先將次氯酸鈉母液稀釋1000倍，然后將其緩慢加入藻液中,混合10 min后,停止通氣,避光放置；18 h后在200 μE光強的人工光下通入空氣與二氧化碳(5%含量)的混合氣，連續培養7 d,每天監控藻細胞的濃度，并在光學顯微鏡下檢查。每組設3個平行樣。

1.5 生物量的測定[21]

取體積量為V的藻液,首先利用離心機以3500 r/min進行離心，分離藻細胞和培養液,藻液中的細菌由于自身質量輕、形態小,將在培養液層存在,該培養液層被去除;再加入體積量為5V的一次水進行藻泥層的溶解,待混勻后進行抽濾,此時將藻細胞截留在濾膜(恒定質量,m0)上,并用等體積量的蒸餾水懸浮藻細胞3次,最后將濾膜于105 ℃的烘箱過夜至恒定質量,冷卻后稱重，得質量m1。藻細胞質量濃度的計算公式為：細胞質量濃度(g/L)=(m1-m0)/V。

2 結果與分析

2.1 致死細菌的分離與鑒定

受到細菌污染的藻液通過稀釋、經過平板劃線法培養，得到24株單細胞菌落,并對每株單細菌的菌落進行二次分離,最后進行細菌的純培養,24株細菌的形態如圖1所示。

圖1 24株分離細菌的形態

將細菌菌液加入藻液中,觀察其致死效果。對24株單菌落細菌進行傳代培養,將活化后的細菌液體5 mL加到30 mL藻液中,培養24 h后,觀察藻細胞生長情況。實驗結果如圖2所示,47#菌液明顯能夠導致藻細胞死亡,其具有溶藻作用。因此,對47#細菌進行菌種的分子鑒定。

提取47#致死細菌的基因組DNA,通過細菌16S rDNA通用引物擴增并測序得到47#細菌的16S rDNA序列,在NCBI上進行Blast比對，結果如圖3所示,其與噬纖維菌目(Cytophagales)嗜冷菌(Algoriphagusnamhaensis, NR_109104.1)的覆蓋率達到99%,一致性達到97%。47#細菌經染色鑒定為革蘭氏陰性菌,存在于微藻海水培養液中,菌落顏色為紅色,這些與噬纖維菌目的生態特點完全符合。該細菌的菌落形態如圖4所示。

2.2 致死細菌的治理方法

2.2.1 治理方法對比 鑒定出的致死細菌屬于噬細胞菌屬。利用我公司在治理細菌污染方面較有效的兩種方法有效氯法和抗生素法對致死細菌進行治理研究。在對噬細胞菌屬滅殺過程中菌體濃度的檢測結果如圖5所示,由圖5可見：噬細胞菌在純海水培養基中生長較慢;在24 h時添加LB培養基后,除0.030 g/L有效氯實驗組的OD580值一直較低外,其它實驗組的OD580值均先后出現增長現象,說明0.030 g/L有效氯對于噬細胞菌屬Algoriphagus的滅殺效果較好,其它方法的滅殺效果均較差。

圖2 22株分離細菌對藻細胞生長的影響

圖3 47#細菌與嗜冷菌16S rDNA的部分序列比較

2.2.2 對嗜冷菌Algoriphagus的32 h和48 h殺滅率 從圖6可以看出：在32 h時不同濃度有效氯對嗜冷菌Algoriphagus的殺滅效果均較好,殺滅率均在80%以上；在48 h時,0.015 g/L有效氯的殺滅率有所下降,而0.030 g/L有效氯的殺滅率一直較高;0.050 g/L慶大霉素的殺滅效果較差,32 h時的殺滅率僅為20%；0.200 g/L慶大霉素在32 h時的殺滅率較高,但48 h后殺滅率下降。因此,0.030 g/L有效氯對嗜冷菌Algoriphagus的滅殺效果最好。

圖4 可導致藻細胞死亡的致死細菌嗜冷菌

圖5 不同治理方法對噬細胞菌屬

圖6 不同治理方法對Algoriphagus的殺滅效果

2.2.3 嗜冷菌Algoriphagus在32 h時的三角瓶照片和在48 h時的涂板結果 從圖7上部可以看出：在實驗32 h時,有效氯實驗組三角瓶中的菌液都較清澈,而慶大霉素實驗組的較渾濁,尤其是0.050 g/L慶大霉素組的渾濁度更高,說明32 h時有效氯對嗜冷菌Algoriphagus的滅殺效果比慶大霉素要好。從圖7下部的涂板結果可見：在48 h時只有0.030 g/L有效氯實驗組的菌落較少,而其它實驗組的菌落均較多。上述結果與細菌液的OD580值結果相吻合。

2.3 對嗜冷菌Algoriphagus治理效果的驗證

2.3.1 治理前后眼點擬微綠球藻細胞的生長情況 由圖8可知,受到噬細胞菌屬污染的CK1組藻液經過幾日的繼續培養,其藻細胞逐漸死亡;通過光學顯微鏡觀察,在藻液中明顯有大量短桿狀的細菌。而在有效氯治理實驗組中藻細胞生長得到明顯的恢復,尤其是在開始階段,細菌受到治理后藻細胞生長恢復到正常。但由于0.015 g/L有效氯(實驗1組)不能完全殺滅嗜冷菌,因此在后期藻細胞的生長速度受到了明顯的抑制,但在7 d的養殖周期內,由于前期細菌被大量殺滅,藻細胞生長狀態逐漸變好,后期藻細胞生長仍較好。實驗2組有效氯的添加量為0.020 g/L,此劑量對藻細胞的影響不顯著,而且對嗜冷菌具有明顯的殺滅作用,因此在該組中藻細胞的生長狀態與未污染的藻細胞相當。而在0.030 g/L有效氯實驗組(實驗3組)中,有效氯的添加量過大,對藻細胞造成了明顯的損傷,導致第1天藻細胞濃度出現負增長；但隨著養殖時間的延長,嗜冷菌被大量殺滅，因此藻細胞的生長狀態得到逐漸恢復,但其仍不如實驗2組的。

2.3.2 方差分析結果 污染藻液治理實驗進行了3輪重復(實驗條件保持不變),均以7 d為培養周期,并以該周期內各實驗組藻細胞生物量增量為考查對象。3輪實驗數據及其方差分析結果見表1、表2、表3。

對3輪養殖實驗數據進行單因素方差分析,F0.05(4,9)=3.48,因此F=593.38>3.48,P<0.05,差異極顯著。說明各實驗組因素均對實驗結果有顯著的影響。

3 討論

微藻戶外規模化養殖過程受污染問題導致戶外養殖產量低,甚至無法養殖。在微藻養殖過程中主要的生物污染源有原生動物、細菌、真菌和其它藻類。由于細菌種類多,繁殖快,治理難,因此對微藻的規模化養殖影響最大。微藻污染菌類不僅與養殖的藻類有關,與養殖時間、環境也關系密切。由于不同微藻養殖過程中污染的細菌完全不同,針對微藻細菌污染的治理方法也完全不同,因此檢測、鑒定微藻養殖過程中污染細菌的屬、種是建立有效的污染防治方法的基礎。

圖7 在實驗過程中嗜冷菌被殺滅情況

圖8 治理前后受污染藻液細胞的生長情況

處理第1輪第2輪第3輪CK1-0.84-0.78-0.82CK22.542.502.45實驗11.791.871.83實驗22.442.602.20實驗31.041.121.09

表2 單因素方差分析結果1

自然界中的細菌種類繁多,只要少部分能夠通過人工培養繁殖并獲得單克隆菌株。如何培養分離獲得微藻養殖過程中的致病菌是一個挑戰。本實驗根據微藻污染細菌的生長特性,嘗試用不同的培養基配方和人工培養條件,將微藻自養培養基與LB細菌異養培養基相結合,獲得了較好的菌株培養與菌落分離效果。通過形態學與分子鑒定分析,獲得了24株不同的細菌菌株,較好地解決了微藻污染菌培養難、分離難的問題。

表3 單因素方差分析結果2

本實驗經過細菌培養、分離菌落與DNA分子鑒定,對微藻污染菌群的細菌組成進行了分析,發現直接導致微藻死亡裂解的細菌為47#菌,該菌在正常養殖階段豐度較低,在微藻受污染暴發時,快速生長繁殖。47#菌為嗜冷菌Algoriphagus,能夠導致微藻絮凝裂解,是導致微藻養殖失敗的主要原因,因此,在微藻養殖過程中如何有效控制47#菌的生長繁殖是微藻污染防治的關鍵。

目前,在微藻開放池養殖過程中進行細菌防治的方法很多,主要有用次氯酸鈉或漂白粉全池潑灑,或用抗生素全池潑灑等方法。本實驗結果表明：雖然0.030 g/L有效氯對47#細菌的治理率高達90%,但該濃度有效氯對藻細胞也具有非常大的損傷；0.020 g/L有效氯對該細菌的治理效果比較理想,既能夠有效地防止微藻養殖過程中的細菌污染,同時對藻細胞的損傷也低。本實驗結果為戶外微藻養殖過程中的細菌污染治理提供了參考,也為細菌污染的深入研究提供了基礎數據。