河南省規模化豬場ESBLs大腸桿菌耐藥基因檢測及分析

張成東，曲久燕*，李德喜，郭海巖，劉夢龍，崔松濤

(1.河南牧翔動物藥業有限公司 豬藥市場部，河南 鄭州 450000；2.河南農業大學 牧醫工程學院，河南 鄭州 450000)

β-內酰胺類抗生素是醫學及獸醫學上使用最早、用量最大的一類抗生素，隨著第三代頭孢菌素的廣泛應用，臨床上也出現了不同程度的耐藥菌[1]。細菌通過產生β-內酰胺酶和超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs)破壞β-內酰胺類抗生素，從而產生耐藥性。近年來，由于各種廣譜及超廣譜藥物的廣泛應用，尤其是不合理應用，使致病菌對抗生素的耐藥性急劇上升，多重耐藥菌株不斷增多[2]，從而影響了藥物的使用。

ESBLs耐藥基因包括CTX-M、TEM、SHV和OXA等[3]，這些基因常定位于質粒上，易于擴散轉移，加速耐藥基因的傳播。

大腸桿菌是人畜腸道共棲菌和條件性致病菌[4-5]，也是產廣譜β-內酰胺酶的代表菌之一。目前對河南省動物源大腸桿菌ESBLs基因研究較多[6-12]，但對豬源大腸桿菌ESBLs基因的系統研究相對較少，不能充分代表河南豬源大腸桿菌ESBLs耐藥基因流行情況。因此，本研究從河南6個地區的10個規模化豬場入手，旨在更客觀地了解豬源性大腸桿菌的ESBLs基因的流行情況及基因型分布情況，不僅可為大腸桿菌相關疾病防控提供科學依據，而且可為豬場獸醫臨床合理用藥提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 采樣對象 2018年8月從豫東(蘭考縣、曹縣)、豫北(輝縣、淇縣)、豫西(博愛縣、沁陽市、宜陽縣)、豫南(遂平縣、西平縣)6個地市9個縣的10個規模化豬場(母豬存欄300～2000頭)取母豬直腸分泌物436份、哺乳仔豬直腸分泌物425份。

1.1.2 標準菌株 大腸桿菌標準質控菌株ATCC25922，購自中國藥品生物制品鑒定所。

1.1.3 培養基 腦心浸液肉湯(BHI)、麥康凱瓊脂購自北京陸橋生物技術有限公司，ECC購自博賽科瑪嘉。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌的分離培養 用滅菌棉棒采豬直腸拭子置入5 mL采樣轉運培養基中，分別取一環菌液劃線于麥康凱培養基進行大腸桿菌的初篩分離，37 ℃過夜培養，選取粉紅色菌落，接種到ECC平板，對大腸桿菌進行純化。

1.2.2 引物設計與合成 根據Genbank公布的ESBLs基因序列，參照文獻[13]和[14]的合成引物，引物由蘇州鴻訊生物技術有限公司合成。

1.2.3 DNA模板提取 采用煮沸法提取菌株DNA模板。挑取過夜培養后處于對數生長期的菌落調入含500 μL無菌生理鹽水的1.5 mL離心管內，充分混勻，放入100 ℃沸水浴中煮沸15 min。10000 r/min離心30 s后，吸取上清液即為擴增模板。從平板挑取疑似大腸桿菌單克隆于2 mL LB肉湯中，37 ℃恒溫搖床200 r/min震蕩培養過夜(約12 h)。菌液離心富集后，加入滅菌的蒸餾水100 μL重懸沉淀。100 ℃煮沸30 min，取出后立即冰浴10 min。12000 r/min離心3 min，取80 μL上清作為PCR模板，-20 ℃冰箱中保存備用。

1.2.4 ESBLs菌基因的PCR檢測 各目的基因片段擴增體系均為20 μL，反應所用的試劑和擴增程序見表1，PCR擴增產物經濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1 PCR擴增體系及其擴增程序

2 結果與分析

2.1 細菌分離情況

河南省6個地區10個豬場861份(母豬436份，哺乳仔豬425份)直腸分泌物中共分離出704株大腸桿菌(圖1、圖2)，分離率為81.77%；其中母豬分離出419株大腸桿菌，檢出率為96.10%；哺乳仔豬分離出285株，檢出率為67.06%。

圖1 大腸桿菌麥康凱培養基分離

2.2 ESBLs 菌耐藥基因檢測及分析

對704株大腸桿菌用8對ESBLs基因擴增引物進行PCR檢測，檢測結果顯示，共從580株菌中檢測出ESBLs基因(表2)，檢出率為82.39%，其中CTX-M、TEM、OXA和SHV基因分別檢出552、231、173和18株，檢出率分別為78.41%、32.81%、24.57%和2.56%；檢測到1種耐藥基因的ESBLs菌284株，占總檢測菌株的40.34%；檢測到2種及以上耐藥基因的ESBLs菌296株，占總檢測菌株的42.05%(其中2種耐藥基因203株、3種耐藥基因88株、4種耐藥基因5株，分別占總檢測菌株的28.84%、12.50%、0.71%)；TEM+CTX-M基因型ESBLs菌224株，占總檢測菌株的31.82%；TEM+OXA+CTX-M基因型ESBLs菌82株，占總檢測菌株的11.65%；TEM+SHV+OXA+CTX-M基因型ESBLs菌5株，占總檢測菌株的0.71%。由PCR檢測結果可知，河南省規模化豬場ESBLs菌陽性率高達82.39%，CTX-M、TEM和OXA是引起ESBLs耐藥的主要基因，表明河南規模化豬場廣泛存在耐β-內酰胺類抗生素的大腸桿菌。部分陽性菌株PCR擴增片段電泳陽性圖見圖3。

圖2 大腸桿菌科瑪嘉ECC培養基鑒定

2.3 母豬ESBLs菌耐藥基因檢測及分析

對母豬樣本分離出的419株大腸桿菌進行ESBLs基因PCR檢測，檢測結果(表3)顯示:共從336株菌中檢測出ESBLs基因，檢出率為80.19%，其中CTX-M、TEM、OXA和SHV基因分別檢出322、144、61和7株，檢出率分別為76.85%、34.37%、14.56%和1.67%；檢測到1種耐藥基因的ESBLs菌180株，占總檢測菌株的42.96%；檢測到2種及以上耐藥基因的ESBLs菌156株，占總檢測菌株的37.23%(其中2種耐藥基因117株、3種耐藥基因36株、4種耐藥基因3株，分別占總檢測菌株的27.92%、8.59%、0.72%)；CTX-M+TEM基因型ESBLs菌138株，占總檢測菌株的32.94%；CTX-M+TEM+OXA基因型ESBLs菌37株，占總檢測菌株的8.83%；CTX-M+TEM+OXA+SHV基因型ESBLs菌3株，占總檢測菌株的0.72%。由PCR檢測結果可知，河南省規模化豬場母豬ESBLs菌陽性率高達80.19%，CTX-M和TEM是引起ESBLs耐藥的主要基因。

表2 河南省規模化豬場ESBLs基因PCR檢測情況

1.CTX-M-2，2.CTX-M-9，3.TEM，4.OXA，5.SHV

2.4 仔豬ESBLs菌耐藥基因檢測及分析

對哺乳仔豬樣本分離出的285株大腸桿菌進行ESBLs基因PCR檢測，檢測結果顯示，共從244株菌中檢測出ESBLs基因(表4)，檢出率為85.61%，其中CTX-M、TEM、OXA和SHV基因分別檢出230、87、112和11株，檢出率分別為80.70%、30.53%、39.30%和3.86%；檢測到1種耐藥基因的ESBLs菌104株，占總檢測菌株的36.49%；檢測到2種及以上耐藥基因的ESBLs菌140株，占總檢測菌株的49.12%(其中2種耐藥基因86株、3種耐藥基因52株、4種耐藥基因2株，分別占總檢測菌株的30.18%、18.25%、0.70%)；CTX-M+TEM基因型ESBLs菌86株，占總檢測菌株的30.18%；CTX-M+OXA基因型ESBLs菌98株，占總檢測菌株的34.39%；CTX-M+TEM+OXA基因型ESBLs菌45株，占總檢測菌株的15.79%；CTX-M+TEM+OXA+SHV基因型ESBLs菌2株，占總檢測菌株的0.70%。由PCR檢測結果可知，河南省規模化豬場哺乳仔豬ESBLs菌陽性率高達85.61%，CTX-M、OXA和TEM是引起ESBLs耐藥的主要基因,哺乳仔豬ESBLs菌耐藥基因攜帶情況比母豬更復雜。

表3 河南省規模化豬場母豬ESBLs基因PCR檢測情況

2.5 不同豬場ESBLs菌耐藥基因檢測及分析

在河南省10個規模化豬場分離的大腸桿菌中(圖4)，1場(樣本量：母豬30+哺乳仔豬29)和2場(樣本量：母豬21+哺乳仔豬24)ESBLs菌的檢出率最高，均為100%；其次是5場和6場的檢出率為94%以上，7場、10場和4場的檢出率為80%以上，8場的檢出率最低，為54.55%。豫東地區的1場和2場耐藥基因型最復雜，CTX-M、TEM、OXA基因檢出率分別為96.61%、100%、74.58%和100%、95.65%、57.78%，其中1場ESBLs菌耐藥基因型最多，同時攜帶CTX-M、TEM、OXA和SHV基因型的菌株檢出率為8.47%，其余各場不存在同時攜帶4種基因型的菌株；豫北地區的3場耐藥基因最單一，僅CTX-M基因的檢出率最高，為71.03%；豫南地區的8場、9場和10場，OXA基因的檢出率高于TEM基因，其他豬場TEM基因的檢出率大于OXA基因檢出率。

表4 河南省規模化豬場哺乳仔豬ESBLs基因PCR檢測情況

3 結論與討論

本研究結果顯示，河南省豫東、豫西、豫南、豫北10個規模化豬場分離的704株大腸桿菌，耐藥基因檢測ESBLs菌檢出率為82.39%(580/704)，高于2009年河南地區報道的78.26%(36/46)[8]和2015年閩西地區報道的28.6%[14]。本研究發現，攜帶1種耐藥基因ESBLs菌284株，占總檢測菌株的40.34%，同時攜帶2種及以上耐藥基因的ESBLs菌296株，占總檢測菌株的42.05%，說明了河南省產ESBLs大腸桿菌耐藥基因更為復雜，規模化豬場廣泛存在耐β-內酰胺類抗生素的大腸桿菌，河南省ESBLs菌耐藥現狀及變化趨勢不容樂觀。

有報道表明，不同國家和地區產ESBLs大腸桿菌的基因型存在一定差異[1，15-17]，我國大陸主要為CTX-M和SHV基因型，與本研究有一定差異。本研究顯示，704株大腸桿菌的CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、CTX-M-25、TEM、OXA和SHV8種基因亞型的檢出率分別為0、38.35%、0、69.89%、0、32.81%、24.57%和2.56%，顯示河南省豬源ESBLs大腸桿菌主要為CTX-M型，TEM型和OXA型次之，SHV型最少，與江西地區較為相似[18]。豫東地區豬場耐藥基因型最復雜，主要為CTX-M、TEM、OXA三種基因型，豫北和豫西地區，主要為CTX-M和TEM兩種基因型，與貴州地區較為接近[19]；豫南地區主要為CTX-M和OXA兩種基因型。本研究發現，母豬群ESBLs大腸桿菌中，TEM基因型檢出率(34.37%)大于OXA基因型檢出率(14.56%)，而在哺乳仔豬群中，OXA基因型檢出率(39.30%)大于TEM基因型檢出率(30.53%)；其中豫南地區3個豬場OXA基因型檢出率較高，且哺乳仔豬與母豬OXA基因型檢出率差異較大，母豬OXA基因型檢出率分別為44.44%(4/9)、1.92%(1/52)、18.33%(11/60),哺乳仔豬OXA基因型檢出率分別為46.15%(6/13)、60.42%(29/48)、39.53%(17/43)。不同地區以及同一地區不同日齡豬群，產ESBLs大腸桿菌基因型存在差異，可能與不同地區以及同一地區不同日齡豬群使用的抗菌藥不同有關[20]。不同基因型產ESBLs菌株間的耐藥性差異需要進一步研究。

圖4 河南省10個規模化豬場ESBLs菌耐藥基因PCR檢測情況

獸醫臨床上抗菌藥的不合理使用，正在誘導、加劇多重耐藥菌的出現，已經嚴重威脅到人類自身健康。豬場應該在獸醫的指導下，依據診斷結果合理選擇敏感的抗生素進行疾病防治，避免抗生素的不合理使用加劇耐藥菌的出現。本研究表明，河南省規模化豬場廣泛存在耐β-內酰胺類抗生素的大腸桿菌，且比2009年更加嚴重，提示我們在臨床上需要選擇更加敏感的抗生素進行ESBLS菌引起的疾病防治。