將熒光檢測技術引入本科實驗教學的實踐與探索

葉 君, 熊 犍, 吳勝龍, 何婉芬

(華南理工大學 輕工科學與工程學院, 廣東 廣州 510640)

2008年的諾貝爾化學獎頒發給了下村修、馬丁·查爾菲和錢永健,以獎勵他們在綠色熒光蛋白(GFP)領域的突出貢獻[1]。瑞典皇家學會諾貝爾化學獎評選委員會對綠色熒光蛋白的評價指出,綠色熒光蛋白已經成為現代生物科學的重要工具之一[2]。以2008年諾貝爾化學獎為契機,熒光探針技術受到了人們的廣泛關注[3-6]。經過多年探究,綠色熒光蛋白在生物醫學界已經得到非常廣泛的應用,以綠色熒光蛋白為基礎發展起來的多色熒光探針技術廣泛應用于生物標記、免疫學、遺傳學等領域[7-11]。

本文將科研新成果應用到本科實驗教學中,構建一種合成條件溫和、操作簡單的新型稀土熒光探針羧甲基纖維素/Tb(Ⅲ)復合物,應用于自來水中Mn2+的檢測。在整個實驗過程中,學生應用自己合成的熒光探針檢測自己生活和工作中的用水,不僅提高了本科生在學科領域中的前瞻性,而且實驗的實用性強、趣味性高,教學質量大大提高,有利于培養本科生的創新思維和創新能力。

1 實驗

1.1 CMC/Tb (Ⅲ) 復合物的制備

將3×10-4mol的TbCl3溶液,緩慢滴加至1%(w%)的羧甲基纖維素(CMC)的溶液中,并輔以攪拌,調節pH值至7,在70 ℃下反應30 min,冷卻至室溫,用透析袋透析,用濃度為0.1 mol/L的AgNO3溶液檢測透析液中的Cl-,直至透析液無白色沉淀為止,然后將樣品置于60 ℃下烘干備用。該反應產物的結構表征,如傅里葉轉化紅外、掃描電鏡等均與文獻[12]一致,說明所合成的產物為CMC/Tb(Ⅲ)復合物。

1.2 MnCl2標準溶液的配制

準確稱量0.125 9 g的MnCl2固體,置于小燒杯中,加入適量的去離子水溶解后,移至10 mL的容量瓶中定容,得到濃度為0.1 mol/L的MnCl2溶液。用移液管移取不同體積的新鮮溶液,分別在100 mL的容量瓶中定容,得到濃度分別為1 mmol/L、0.8 mmol/L、0.6 mmol/L、0.4 mmol/L、0.2 mmol/L、0.1 mmol/L、0.08 mmol/L、0.06 mmol/L、0.04 mmol/L、0.02 mmol/L、0.01 mmol/L、1 μmol/L、0.1 μmol/L的MnCl2標準溶液。

1.3 熒光探針對Mn2+的檢測

用移液管分別移取不同濃度的MnCl2溶液加入到1%的 CMC/Tb(Ⅲ)懸浮液中,將其混合均勻,反應3 min后,移至石英比色皿中,置于熒光光譜儀中以波長為 370 nm的激發光激發檢測其熒光光譜,通過對CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針熒光光譜特性的變化的研究,探究不同濃度的Mn2+對CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針熒光性質的影響。

1.4 熒光探針對自來水中的Mn2+的檢測

采用加標回收法[13]檢測自來水中Mn2+的濃度。實驗中所用的自來水采集自某大學的食堂、宿舍及實驗室3個不同的供水系統。將不同量的MnCl2加入到上述水樣中,制得濃度為10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L的MnCl2標準溶液。將不同濃度的MnCl2標準溶液,分別用移液管移取0.6 mL,加入至 2.4 mL質量濃度為1%的CMC/Tb (Ⅲ)熒光探針中, 反應3 min后,測試其熒光強度的變化。測試條件與以上實驗條件保持一致。

2 實驗結果與討論

2.1 熒光探針的選取

不同濃度的CMC/Tb (Ⅲ) 懸浮液在波長為370 nm的激發光激發下的熒光性質如圖1所示。從圖1的熒光發射圖譜中,可以觀察到在489、544、585 及 606 nm處共有4個發射峰,他們分別歸屬于從Tb3+的5D4能級到7FJ(J = 6, 5, 4, 3)能級的電子躍遷[14],這說明制備的CMC/Tb(Ⅲ)懸浮液展現出鋱的特征發射圖譜。此外,隨著CMC/Tb (Ⅲ)濃度的增加,CMC/Tb (Ⅲ)懸浮液的熒光強度FI也在不斷增加。當懸浮液的濃度控制在1%時,該懸浮液依舊具有很高的熒光強度,該強度仍可滿足后續實驗中對CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針的熒光強度的檢測要求,并且該濃度條件下的懸浮液仍然具有很高的同質性和穩定性,出于成本和對環境保護等方面的綜合考慮,采用質量濃度為1.0%的CMC/Tb (Ⅲ) 懸浮液作為后續實驗的熒光檢測探針。

圖1 不同濃度(0.5%～5%)的CMC/Tb(Ⅲ)懸浮液 熒光光譜對比

2.2 CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針對水溶液中Mn2+ 檢測的選擇性

圖2 陽離子對CMC/Tb (Ⅲ)熒光強度的影響

陰離子對CMC/Tb (Ⅲ)熒光探針熒光強度的影響如圖3所示。與上述陽離子的影響類似,當Mn2+加入至上述其他金屬離子與CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針的混合溶液后,CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針在544 nm處的熒光強度出現明顯下降。這表明其他的金屬離子及陰離子對CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針的熒光強度并沒有明顯的影響,且當其他陽離子存在時并不會對Mn2+與CMC/Tb(Ⅲ)的相互作用產生干擾,也就是說CMC/Tb(Ⅲ) 熒光探針對Mn2+的檢測具有很好的選擇性。

圖3 陰離子對CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針熒光強度的影響

2.3 CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針對水溶液中Mn2+ 的熒光響應

為了確定CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針在對Mn2+檢測的應用表現,如檢測的靈敏性等,考察了不同濃度的Mn2+對CMC/Tb (Ⅲ)熒光探針熒光強度的影響,結果如圖4所示。

圖4 不同濃度的Mn2+對CMC/Tb(Ⅲ)熒光強度的影響

在加入Mn2+后,熒光探針依舊表現出鋱的特征發射光譜,但是隨著Mn2+濃度的增加,CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針在544 nm處的熒光強度也隨之降低,當 Mn2+的濃度增加至1 mmol/L時,CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針在544 nm處的熒光強度降低至最初強度的23.4%。另外,當以365 nm紫外光照射CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針時,可以觀察到明顯的綠色熒光,隨著Mn2+濃度的增加,CMC/Tb (Ⅲ) 熒光探針在紫外燈下發射的綠色熒光也逐漸變弱,直至完全消失。CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針的這種可見綠光顏色的變化,有助于通過肉眼對水溶液中Mn2+的存在與否進行快速直觀的判斷。更重要的是,當Mn2+的濃度范圍在0.1～100 μmol/L時, CMC/Tb (Ⅲ)熒光探針在544 nm處的熒光強度與Mn2+的濃度之間具有良好的線性關系(相關系數R2=0.9924)。用Borràs方法[15]得到其檢出限為0.046 μmol/L(信噪比為3),該檢出限遠低于美國環境保護署(0.3 mg/L)以及世界衛生組織(0.4 mg/L)在飲用水中的最高限量標準[16]。通過以上的分析和討論,發現CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針對于水溶液中Mn2+的檢測具有很高的靈敏性。

2.4 CMC/Tb (Ⅲ) 熒光探針對Mn2+的熒光響應時間

為了提高CMC/Tb (Ⅲ)熒光探針在Mn2+檢測中的準確度,研究了二者之間的響應時間對熒光強度的影響。如圖5所示,Mn2+對CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針的熒光響應非常迅速,在1 min內熒光響應已經幾乎達到穩定狀態,這表明CMC/Tb (Ⅲ)熒光探針對水溶液中的Mn2+具有快速響應的能力,可以實現對水溶液中Mn2+的快速檢測。為了確保Mn2+與CMC/Tb (Ⅲ) 熒光探針之間能夠完全反應,使實驗具有更高的準確性,選擇反應時間為3 min作為在實際應用中的檢測時間。

圖5 反應時間對CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針熒光強度的影響

2.5 自來水中Mn2+的檢測

為了進一步證明該探針在實際環境中的可用性和實用性,采用加標回收法對CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針在檢測自來水中的Mn2+的應用表現進行了研究。將不同量的MnCl2樣品加入到自來水中配置得到MnCl2的標準溶液,以CMC/Tb(Ⅲ)作為熒光探針對該樣品進行檢測,結果如表1所示。Mn2+在標準自來水溶液中的回收率在97.10% 到101.61%之間,并且所有樣品的相對標準偏差(RSD, n=5)小于2.04%。這些數據表明,CMC/Tb(Ⅲ)熒光探針在自來水中Mn2+的檢測中顯現出很好的準確性和可行性。

表1 Mn2+ 在自來水樣品中的回收率

2.6 實驗小結

(1) CMC/Tb(Ⅲ)復合物熒光探針在水溶液中Mn2+的檢測中顯現出快速熒光響應的良好性能,并且對Mn2+的檢測上具有很高的選擇性和靈敏性。該探針對Mn2+的熒光響應可以在1 min內達到穩定,且其他離子對CMC/Tb(Ⅲ)探針檢測Mn2+的干擾性很小。

(3) 該探針可以應用于自來水中Mn2+的檢測,可實現對水溶液中Mn2+的快速檢測。與其他的 Mn2+檢測方法相比,所合成的CMC/Tb (Ⅲ)熒光探針具有合成過程簡單、反應條件溫和的優勢,并且具有操作簡便、靈敏性高、抗干擾性好的特點。

3 教學效果

3.1 開拓知識視野

將研究領域中的前沿成果引入本科實驗教學,對學生來說,可以增加專業理論知識,開闊視野,提高專業興趣,激發好奇心,提升發現問題的能力。

3.2 培養創新意識

通過該實驗,學生不僅能加深對本專業前沿領域的理解,還可聯系水安全這樣的熱點問題,逐步培養學生形成創新意識所必需的素養,諸如興趣愛好、求知欲望以及好奇心態等,從而培養學生對待創新的自覺的、主動的態度[17]。