基于網絡藥理學探討朱日亨滴丸治療冠心病的分子機制*

慕桂娟，陸景坤，王躍武，孫雨輝，那生桑，孫宇鑫，胡玉崇

(1.內蒙古自治區包頭市中心醫院藥械科，包頭 014000；2.內蒙古醫科大學基礎醫學院，呼和浩特 010059；3.內蒙古醫科大學新藥臨床前安全性評價中心，呼和浩特 010059；4.內蒙古醫科大學藥學院，呼和浩特 010059； 5.內蒙古醫科大學蒙醫藥研究院，呼和浩特 010059；6.內蒙古自治區烏蘭察布市察后右旗中心醫院信息科，烏蘭察布 012400；7.內蒙古自治區人民醫院，呼和浩特 010059)

朱日亨滴丸處方源于臨床驗方，臨床上用于治療冠心病、“心刺痛”，療效顯著。朱日亨滴丸(曾用名朱日很滴丸)由廣棗、肉豆蔻、檀香、梔子、沉香等多味藥材組成，選藥組方基于蒙醫治療心刺痛理法：方中廣棗性味甘、酸而平；效重、膩。性味與效能鎮“赫依”，作為君藥。肉豆蔻性味辛而溫，主鎮司命“赫依”為臣藥。再加檀香性寒，清博熱，組成檀香三味主治心熱、心血熱。輔以止痛、清血熱沉香、梔子等藥材，具有清心火、活血化瘀、改善心功能的功效；用于心慌、氣短、胸悶煩躁。在臨床上用來治療冠心病、心絞痛等均有很好的療效。朱日亨組方中各單味藥多含有心血管系統藥效活性成分。例如廣棗中的黃酮、有機酸、酚酸能夠減輕心肌缺血-再灌注損傷[1]；酚酸成分沒食子酸能夠通過調節分裂素活化蛋白激酶9(mitogen-activated protein kinase 9，JNK2)和分裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，ERK)磷酸化抑制小鼠心肌肥厚和纖維化[2]；鞣花酸可以減輕大鼠全腦缺血/再灌損傷，對高血壓大鼠的心血管損傷有保護作用[3]；黃酮類成分兒茶素能夠通過Akt/mTOR途徑抑制神經膠質細胞自噬和凋亡[4]。肉豆蔻揮發油成分能夠明顯減慢心率，降低心律失常的發生率[5]；肉豆蔻中四氫呋喃類木脂素愈創木素和machilin A 能活化AMPK，治療二型糖尿病等代謝綜合征；二芳基丁烷類木脂素肉豆蔻木酚素能活化MAPK，發揮抗炎作用；苯并四氫呋喃類木脂素Myrisfrageal A和B、licarin A 能抑制一氧化碳，發揮抗炎作用[6]。網絡藥理學其所強調的整體性與系統性和傳統醫藥整體觀與辯證論治不謀而合，近年來，網絡藥理學已經成功運用于六味地黃丸、四物湯、復方丹參等經典方劑的機制、配伍等研究中[7]。因此，本實驗采用網絡藥理學方法初步探討蒙藥方劑朱日亨滴丸治療冠心病的分子作用機制和潛在活性成分。

1 方法

1.1朱日亨滴丸的化合物收集 文獻挖掘，中醫藥資料庫@Taiwan(http：//tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/index.php)和Therapeutic Targets Database(TTD，http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/TTD_HOME.asp)數據庫檢索收集整理朱日亨滴丸中廣棗、肉豆蔻、檀香中化學成分，中醫藥資料庫@Taiwan收集檢索沉香、阿魏等藥材的化學成分，如有糖苷類化合物脫葡萄糖基變為苷元，所有化合物經中藥系統藥理學資料和分析平臺(TCMSP，http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)進行口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug similarity，DL)分析(TCMSP 網站標準：OB≥30%；DL≥0.18)，或Lipinski類藥五原則分析，收集篩選朱日亨滴丸候選化合物。

1.2“化合物-靶點-冠心病相關基因”關聯的建立 經ChemBioOffice2011軟件將候選化合物轉化成MDL sdf.格式文件或 MOL2格式文件，上傳至PharmMapper數據庫(http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/)進行靶點預測，通過反向藥效團匹配方法，搜尋潛在藥物靶點，預測化合物的生物活性。檢索UniProt數據庫(http：//www.uniprot.org/)，輸入UniProt編號將蛋白校正為官方名稱，根據上述的數據庫檢索與轉化，獲得相關的蛋白信息。借助冠心病網絡藥理學研究平臺CHD@ZJU V2.0(http：//pharminfo.zju.edu.cn/chd)和OMIM數據庫(http：//omim.org/)收集有文獻報道與冠心病發病機制相關的基因，進行化合物靶點和冠心病相關基因比對，得到朱日亨滴丸與冠心病機制相關的靶點網絡。

1.3通路獲取與分析 將通過Pharmmapper獲取的靶點導入MAS3.0(http：//bioinfo.capitalbio.com/mas3/)，條件選擇：Homo sapiens(Human)；Molecule Type：Protein；Database Symbols：UniProtKB；Functions：Gene，mRNA，Protein，GO，Pathway，CoregulatedGene，Disease，Interaction；Regulation Threshold：Up 2.0，Down 0.5。在提交得到的結果中，選擇pathway中的KEGG數據進行通路注釋與分析，并得到相關的信息。

1.4構建朱日亨滴丸的“化合物-靶點-通路”網絡模型 根據上述化學成分的靶點預測結果，應用cytoscape3.5.0軟件構建“化合物-靶點-通路”網絡。通過網絡分析，研究朱日亨滴丸的多靶點作用及其潛在治療作用的特異性。

1.5構建朱日亨滴丸的“化合物-靶點-藥物”網絡模型 查詢Drugbank(https：//www.drugbank.ca/)和TTD數據庫，依據ATC分類(http：//www.drugbank.ca/atc)獲得所有美國食品藥品管理局(FDA)批準的治療冠心病的小分子西藥及其靶點信息。利用pharmmapper獲得的靶點與西藥的共靶信息，構建“化合物-靶點-藥物”的關聯網絡，該關聯網絡包括朱日亨滴丸、治療冠心病的西藥、預測靶點和西藥共有的靶點。然后，利用已知作用機制的西藥在該網絡中分析朱日亨滴丸治療冠心病的可能機制。

2 結果

2.1朱日亨滴丸活性成分的潛在靶點信息 應用Pharmmapper在線預測朱日亨滴丸化合物的靶點，通過冠心病相關靶點與Pharmmapper得到的靶點結果進行比對，得到朱日亨滴丸化合物預測靶點與冠心病機制匹配的靶點共85個(總頻次為1044)，頻次為10次以上的靶點見表1，共38個靶點，頻次為671次，占總頻次的64.3%。

2.2朱日亨滴丸化學成分潛在靶點的通路富集 將朱日亨滴丸化學成分的所有預測靶點應用MAS 3.0在線工具進行KEGG通路注釋，得到相關通路87條(P<0.01)，其中與心血管疾病相關的有43條，前10條見表2。其中與信號轉導相關的為3條，包括VEGF信號通路(VEGF signaling pathway)、ErbB信號通路(ErbB signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)；與細胞進程相關的為3條，包括黏著斑(focal adhesion)、黏附連接(adherens junction)、肌動蛋白細胞骨架調節(regulation of actin cytoskeleton)；與內分泌系統相關的為2條，包括胰島素信號通路(insulin signaling pathway)、PPAR信號通路(PPAR signaling pathway)；與免疫系統相關的為2條，包括Fc & RI信號通路(Fc epsilon RI signaling pathway)、T細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)；結果表明朱日亨滴丸可能通過調節信號轉導、細胞進程、內分泌、免疫、代謝等多個途徑發揮治療冠心病的作用。

2.3朱日亨滴丸“化合物-靶點-通路”網絡模型 采用Cytoscape軟件建立朱日亨滴丸“化合物-靶點-通路”網絡模型，化合物、靶點以及通路結果的關聯關系直觀地呈現于圖1。通過網絡拓撲學分析朱日亨滴丸分子與靶蛋白的D-T 網絡特征，如網絡度、介數[8]。網絡模型分析發現，高網絡度化合物往往有較高的介數，而這些具有較高介數和網絡度的靶點提示可能在生物網絡系統中發揮重要作用。

表1朱日亨滴丸化學成分的潛在靶點(頻次≥10)

Tab.1PotentialtargetofchemicalcomponentofZhuRihengdroppill(frequency≥10)

名稱靶點頻次酪氨酸蛋白磷酸酯酶非受體1型PTPN187視黃酸受體RXR-αRXRA70維生素D3受體VDR67醛糖還原酶AKR1B150雙特異性有絲分裂激活蛋白激酶1MAP2K149糖皮質激素受體NR3C146雄激素受體AR41熱休克蛋白 HSP 90-αHSP90AA141性激素結合球蛋白SHBG40促分裂原活化蛋白激酶 14MAPK14393-磷酸肌醇依賴蛋白酶1PDPK139血清白蛋白ALB37凝血素F227脂肪酸結合蛋白FABP327基質溶素-1MMP323cAMP特異性 3',5'-環磷酸二酯酶 4DPDE4D23中性白細胞彈性蛋白酶ELANE22細胞周期素-A2CCNA221肽基-脯氨酰順反異構酶FKBP1A20血管內皮生長因子受體 2KDR20組織蛋白酶 KCTSK18半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3CASP314cAMP-依賴蛋白激酶催化亞基 αPRKACA13原癌基因酪氨酸蛋白激酶SrcSRC13二肽基肽酶Ⅳ DPP412雌激素受體βESR212

表2朱日亨滴丸潛在靶點富集與冠心病相關的通路

Tab.2EnrichedpathwaysofpotentialtargetassociatedwithcoronaryheartdiseaseforZhuRihengdroppill

通路分類p-值黏著斑細胞過程2.90×10-19胰島素通路內分泌系統5.49×10-18VEGF通路信號傳導3.87×10-17Fc & RI通路免疫系統1.16×10-13T 細胞受體通路免疫系統1.58×10-13ErbB 通路信號傳導3.48×10-13PPAR通路內分泌系統1.19×10-12粘附連接細胞過程4.16×10-12MAPK 通路信號傳導4.36×10-12肌動蛋白細胞骨架調節細胞過程5.72×10-10

2.4網絡拓撲學分析 網絡拓撲學分析結果見圖1。結果顯示PTPN1、RXRA、MAP2K1、MAPK14、PDPK1在靶點中介數最高；VEGF信號通路、胰島素信號通路、MAPK信號通路、黏著斑、粘附連接、T細胞受體信號通路、B細胞受體信號通路在通路中影響最顯著；廣棗的脂肪酸類2-isopropylmalic acid(gz1)介數排序第一，其次為肉豆蔻的苯丙素類p-cymene(rb7)和二芳基丁烷類木脂素myrislignan(rx6)；排序在前面的20個化合物有16個化合物為基礎方中廣棗、肉豆蔻、檀香的化合物，三味藥材各占1/3。廣棗、肉豆蔻、檀香的化合物平均介數值分別為0.004 766，0.003 635，0.003 525，均高于其他藥材化合物平均介數(0.001 307 2～0.002 925 3之間)，以上結果充分證明廣棗、肉豆蔻、檀香在朱日亨滴丸的組方配比中占主要位置。朱日亨滴丸與冠心病相關靶點網絡度大于10的見表3；朱日亨滴丸化合物中介數大于0.007的重點化合物見表4。

*1節點大小代表“網絡度”大小，節點顏色代表節點的“介數”高低，暖色代表高，冷色代表低

圖1朱日亨滴丸“化合物-靶點-通路”網絡模型

*1The node size represents the value of “network degree”；the node colour represents “betweenness”；warm colour represents high degree and cool colour represents low degree

Fig.1Networkmodelof“compound-target-pathway”ofZhuRihengdroppill

2.5朱日亨滴丸主要活性成分的潛在靶點-冠心病藥物關聯網絡分析 基于朱日亨滴丸和已知治療冠心病的西藥的共靶信息，構建朱日亨滴丸作用靶點-藥物關聯網絡，見圖2。朱日亨滴丸與西藥有11個共同靶點，靶點分別為NR3C1、NR3C2、PDE4D、PDE4B、PROCR、PPARG、F2、ACE、HMGCR、MMP2、NQO1。涉及到腎素-血管緊張素系統藥物、抗血栓藥、鈣通道阻滯劑、周圍血管保護劑、調血脂藥和其他類等共55個治療冠心病的西藥。其中，腎素-血管緊張素系統藥物的靶點為ACE、MMP2、PPARG；抗血栓藥的靶點為PDE4D、PDE4B、PROCR、F2、NQO1；鈣通道阻滯劑的靶點為NR3C2；周圍血管保護劑的靶點為NR3C1、PDE4B；調血脂藥的靶點為PPARG、HMGCR。結果進一步說明，朱日亨滴丸是通過抗凝、調節激素分泌、影響腎素-血管緊張素系統、調脂等發揮治療冠心病的作用。

表3朱日亨滴丸冠心病關鍵靶點的(網絡度≥10)網絡拓撲學參數

Tab.3NetworktopologyparametersofkeytargetsassociatedwithcoronaryheartdiseaseforZhuRihengdroppill(degree≥10)

靶點介數度PTPN10.250 162 2866RXRA0.169 345 9652MAP2K10.162 111 1351MAPK140.113 866 5038PDPK10.095 717 4233F20.044 716 8822PDE4D0.033 267 2721FABP30.031 222 4819CCNA20.032 142 1118靶點介數度KDR0.036 416 4616SRC0.019 978 5315AKT10.017 613 1815MAPK10.007 825 9414CASP30.028 233 2914RAC10.007 704 0512GSK3B0.011 097 2411RAF10.004 664 9911

表4朱日亨滴丸重點化合物(介數≥0.007)的網絡拓撲學參數

Tab.4NetworktopologyparametersofkeycompoundsofZhuRihengpill(betweenness≥0.007)

編碼化合物介數度gz12-isopropylmalic acid0.020 234 797rb7 對傘花烴(p-cymene)0.018 124 388rx6肉豆蔻木脂素(myrislignan)0.016 555 826aw10密葉辛木素(confertifolin)0.013 682 054tq4表洛柯皂苷元(16-episarpagine)0.013 462 436tb16β-檀香醇(beta-santalol)0.012 554 325rz7肉豆蔻木酚素(macelignan)0.010 916 485rt3γ-萜品烯(γ-terpinene)0.010 650 876CX1(+)-guaia-1(10),11-dien-9-one0.010 419 945gq15-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural)0.009 960 196gf33,3’ -二甲基鞣花酸(3,3’ -dimethyl ellagic 0.009 111 265 acid)tb21α-檀香醇(alpha-santalol)0.008 708 335gf5bis[(2S)-2-ethylhexyl]benzene-1,2-dicarboxy-0.008 593 325 latert10β-水芹烯(β-phellandrene)0.008 590 015CX2(+)-methyl selina-4,11-dien-14-oate0.008 024 135ts3富貴草堿(terminaline)0.007 968 115tb27檀油酸(teresantalic acid)0.007 597 295gf11原兒茶酸(protocatechuic acid)0.007 242 124CX131,6-dihydroxy-2,4-dimethoxyanthranquinone V0.007 108 025tb6檀烯酮(santenone)0.007 009 345

*1節點大小代表“網絡度”大小，節點顏色代表節點的“介數”高低，暖色代表高，冷色代表低

圖2朱日亨滴丸作用靶點-西藥關聯網絡

*1The node size represents the value of “network degree”；the node colour represents “betweenness”；warm colour represents high degree and cool colour represents low degree

Fig.2CorrelativenetworkofthetargetsbetweenZhuRihengdroppillandwesternmedicine

3 討論

網絡藥理學對化合物群預測的靶點基因進行信號通路富集得到的通路能反應該化合物群組對相關疾病的作用機制。通路富集結果提示朱日亨滴丸對冠心病、心肌缺血的治療作用與影響應激反應(胰島素信號通路(主要為RISK信號通路)、MAPK信號通路、ErbB信號通路、mTOR信號通路)，動脈粥樣斑塊的行成(細胞粘附，粘附連接)，斑塊不穩定性(VEGF信號通路)，血管內皮損傷(細胞粘附，粘附連接，PPAR信號通路)，免疫與炎癥反應(Fc&RI途徑、T細胞受體信號通路、B細胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、自然殺傷細胞細胞毒活性、PPAR信號途徑)，脂代謝(PPAR信號途徑、脂肪因子信號途徑)密切相關。

在網絡中，高介數的節點稱為瓶頸節點、高連接度的節點稱為網絡的樞紐，這些拓撲學屬性都能反應節點在網絡中的重要性[8-9]。朱日亨滴丸網絡拓撲學及生物學功能分析表明，綜合排序靠前的PTPN1、RXRA、PDPK1、MAPK14等10個靶點很有可能是朱日亨滴丸治療心血管病的主要靶點，這些靶點多為應激反應、血管內皮損傷、炎癥等信號通路的關鍵基因，朱日亨滴丸主要活性成分與治療冠心病的腎素-血管緊張素系統藥物、抗血栓藥、鈣通道阻滯劑、周圍血管保護劑、調血脂藥等均存在共靶，進一步說明朱日亨滴丸治療冠心病、心肌缺血是通過多靶點、多途徑發揮作用。化合物節點的網絡拓撲學分析結果表明，介數及網絡度排序在前面的20個化合物有16個化合物為基礎方中廣棗、肉豆蔻、檀香的化合物，三味藥材各占1/3。其平均介數值均高于其他藥材化合物平均介數，其中，廣棗的平均介數最高，以上結果充分證明廣棗的君藥地位，廣棗、肉豆蔻、檀香在朱日亨滴丸的組方配比中占主要位置。排序靠前的化合物可以作為物質基礎的重點探究對象進一步實驗驗證。

冠心病發展過程中涉及的炎癥、脂代謝、動脈粥樣硬化、氧化應激等病理過程，對朱日亨治療冠心病的網絡藥理學驗證及機制探討需建立不同模型進行分析； 尚需要通過進一步基因、蛋白表達的檢測，物質基礎與分子靶點間的關系尚需進一步單體成分的藥效學研究。