維生素C抗氧化-同位素內標稀釋-超高效液相色譜-串聯質譜同時測定新生期大鼠海馬體神經遞質的含量

鄺洪軒, 張海彬, 譚建華, 雒亦凡, 劉舒華, 龐啟華,2, 李楚華, 范瑞芳*

(1. 華南師范大學生命科學學院, 廣東省藥食資源生物加工及綜合利用工程技術研究中心, 廣東 廣州 510631; 2. 廣東工業大學環境科學與工程系, 廣州市環境催化與污染控制重點實驗室, 廣東 廣州 510006; 3. 廣州質量監督檢測研究院, 廣東 廣州 511447)

神經遞質(neurotransmitters)是一類由神經元合成并釋放,通過突觸傳遞完成神經元之間信號傳遞的化學物質?；谖镔|的結構和化學性質,神經遞質可分為氨基酸類(如谷氨酸(glutamic acid, Glu)、γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid, GABA))、生物胺類(如5-羥色胺(serotonin, 5-HT)、多巴胺(dopamine, DA))以及膽堿類(如乙酰膽堿(acetylcholine, Ach))。機體中樞神經系統的神經遞質參與多種生理活動,包括睡眠、學習、記憶、情緒反應、精神活動等。個體大腦中樞神經遞質的變化直接影響生物體的行為和活動,進而誘導精神病學和神經病學疾病的發生[1]。因此簡單、準確、快速檢測生物體內神經遞質的含量,對于準確解釋神經生理活動機制具有重要的意義。

部分神經遞質光敏感性強、極易被氧化(如多巴胺),且在生物樣品中的含量很低,樣品基質復雜[2],因此如何避免神經遞質被氧化的樣品前處理方法和高靈敏度的檢測手段是神經遞質含量測定研究的重點。高效液相色譜(HPLC)分離后用紫外(ultra violet)[3]、熒光(fluorescence)[4-6]、電化學(electrochemical detection)[7-9]和質譜(mass spectrometry)[1,2,10,11]方法檢測,是目前神經遞質測定較常用的方法。但前3種檢測方法一般需要對神經遞質進行衍生化處理,不僅衍生步驟繁瑣,耗時耗力,而且存在有機體內源性類似物的干擾,生成非目標衍生物,衍生程度也難以保證。而超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)法兼具分離能力和靈敏度高、特異性好等優勢,已逐漸成為生物樣品中痕量生物活性物質分析的強有力手段[12-14]。

本研究建立了同位素稀釋-UPLC-MS/MS法同時測定大鼠海馬體5種神經遞質(Glu、GABA、Ach、DA和5-HT)的快速分析方法。該方法重現性好,靈敏度高,無需進行衍生化處理,且維生素C(vitamin C, VC)的加入有效地解決了DA和5-HT前處理和儲存過程中的氧化問題,并成功應用于新生期雙酚A(bisphenol A, BPA)暴露后大鼠海馬體5種神經遞質含量的定量分析,為以動物和細胞為對象的毒理研究提供了神經遞質的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與化學試劑

超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀(UltiMateTM3 000標準四元系統液相色譜,TSQ Quantiva三重四極桿質譜儀,Thermo Fisher Scientific公司,美國);氮吹儀(DC-12,上海安譜科學儀器有限公司);低溫離心機(3K15, Sigma公司,美國);超聲儀(SB-1000,寧波新藝超聲設備有限公司);分析天平(BSA224S,賽多利斯公司,德國)。

標準品:5-羥色胺、5-羥色胺-D4、谷氨酸-D5、乙酰膽堿、乙酰膽堿-D9、γ-氨基丁酸和γ-氨基丁酸-D6購自加拿大TRC公司;谷氨酸、多巴胺和維生素C購自美國Sigma公司;多巴胺-D4購自加拿大CDN同位素公司;乙酰膽堿的純度為95%,其他標準品純度均大于98%。其他實驗用的試劑包括甲醇、乙腈、甲酸和乙酸等均為色譜純,購自美國Sigma公司。

1.2 標準樣品的制備

儲備液的配制:分別準確稱量各神經遞質標準品,溶于2%(體積分數,下同)乙酸水-甲醇溶液(1∶1, v/v),配制成質量濃度范圍為1～5 g/L的單標準品儲備液。準確稱取100 mg VC標準品,溶于2%乙酸水溶液中,配制成10 g/L的儲備液,并充入足量氮氣。所有儲備液放置于-20 ℃冰箱儲存備用。分別移取定量單標準儲備液至容量瓶中,加入2%乙酸水-甲醇溶液(9∶1, v/v)定容,制成混合標準溶液;然后依次用不同體積的2%乙酸水-甲醇(1∶1, v/v)溶液稀釋混合標準溶液,配成6個不同濃度的標準溶液樣品混合液,用于制作標準曲線。

1.3 色譜與質譜條件

色譜條件:選擇Ultimate AQ-C18(150 mm×4.6 mm, 3 μm,上海月旭公司)色譜柱作為分離柱;流動相由A相(0.1%甲酸水)和B相(甲醇)組成;流速:0.4 mL/min;柱溫:28 ℃;進樣量2 μL。梯度洗脫程序:0～1.00 min, 20%B; 1.00～2.00 min, 20%B～50%B; 2.00～2.50 min, 50%B～100%B; 2.50～6.00 min, 100%B; 6.01 min, 20%B; 6.01～10.00 min, 20%B。

表 1 質譜參數Table 1 Mass parameters

* Transitions used for quantification. CE: collision energy; RF: radio frequency; Ach: acetylcholine; 5-HT: serotonin; GABA:γ-amino butyric acid; DA: dopamine; VC: vitamin C.

質譜條件:電噴霧離子(ESI)源,負離子模式;噴霧電壓:3 500 V;鞘氣流速:30 Arb;輔助氣流速:15 Arb;離子傳遞管溫度:325 ℃;霧化器溫度:350 ℃。優化了各分析物的碰撞能量和透鏡電壓,并選擇合適的定量和定性離子對,用多反應監測(MRM)模式進行定量。具體參數見表1。

1.4 樣品前處理

哺乳期大鼠BPA暴露14天后,將其頸椎脫臼處死,取全腦。在冰浴中小心剝離出海馬體,準確稱重后放入1.5 mL的塑料離心管中。加入250 μL 2%甲酸水和50 μL 10 g/L VC,勻漿2 min后繼續超聲提取15 min,然后在13 000 r/min的速度下離心40 min。取150 μL上清液至不含BPA的塑料離心管中。依次加入100 μL混合同位素內標和1 mL 2%甲酸乙腈溶液,充分渦旋振蕩,使蛋白質沉淀。在13 000 r/min的速度下離心20 min,取625 μL上清液至干凈的玻璃試管中,氮氣吹干。加入1 mL 2%乙酸水-甲醇(9∶1, v/v)溶液復溶,在12 000 r/min的速度下離心5 min,取700 μL上清液于2 mL液相自動進樣瓶中,充入氮氣,于-20 ℃冷凍保存待測。

1.5 質控樣品

按照標準曲線樣品的配制方法,分別配制低、中和高水平的質控樣品(Glu: 1 500、7 500和15 000 μg/L; GABA: 250、1 250和2 500 μg/L; Ach: 1.5、7.5和15 μg/L; 5-HT: 1、5和10 μg/L; DA: 1、5和10 μg/L)。此外,每一批次處理還包括兩個空白樣品,包括方法空白樣品(前處理方法同實際樣品,加入等量同位素內標)和溶劑空白樣品(樣品處理方法同空白樣品,但是不加入同位素內標)分別用以監控處理過程中由于各種操作原因造成的污染和添加各種化學品引入的本底污染。所有標準曲線、質控樣品的前處理方法與實際樣品等同。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

由于神經遞質化合物極性較強,因此選擇了3種不同型號的、具備一定極性保留能力的反相液相色譜柱優化分離目標化合物,分別為ACQUITY UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm, Waters公司,美國)、Ultimate AQ-C18柱(150 mm×4.6 mm, 3 μm,上海月旭公司)和ACE C18-PFP柱(150 mm×4.6 mm, 3 μm, ACT公司,英國)。由于Ach在ACQUITY UPLC HSS T3柱中峰形拖尾,而ACE C18-PFP柱對神經遞質的保留較弱導致分離度不佳,最終選擇Ultimate AQ-C18柱作為分離柱。該色譜柱是以B型超高純全多孔球形硅膠為基質,碳載量高達12%,這使其不僅色譜峰形、分離效率、穩定性和重現性均極佳,且對親水性和極性化合物具有更強的保留能力和選擇性。

試驗中發現,當用于溶解樣品的溶液中甲醇比例較高時,色譜分離中無論如何調整流動相比例或更換其他型號的色譜柱,5-HT峰形分叉嚴重(見圖1)。而當甲醇體積分數低于10%時,各類化合物均具有良好的峰形。因此,優化了氮氣吹干后復溶目標化合物的甲醇比例?？紤]到5-HT具有一定的疏水性以及穩定性,綜合考慮后選用2%乙酸水-甲醇溶液(9∶1, v/v)作為樣品溶解液而非2%乙酸水。

圖 1 溶解樣品溶液的甲醇體積分數對5-HT的色譜分離影響Fig. 1 Effects of the methanol volume percentages in re-dissolution solutions on the chromatogra-phic separation of 5-HT HAc: ethanoic acid; MeOH: methanol.

在梯度洗脫程序的優化過程中發現,Ach拖尾嚴重,這種現象均存在于上述3種色譜柱中,即使往流動相中添加乙酸銨也不能明顯改善拖尾程度。多次調整流動相比例后發現,甲醇比例提高后,起始柱壓升高可以顯著改善Ach的拖尾現象。因此,梯度洗脫程序選擇了20%甲醇作為起始流動相比例。部分神經遞質(如Glu)在腦中的含量很高(大于1 mg/g)[12],為了防止化合物的進樣殘留對后一個樣本定量分析準確性的影響,使用100%甲醇充分沖洗柱子達3.5 min。結果顯示,5種神經遞質的進樣殘留率(carry-over)為1.4%～5.2%,符合歐洲藥品管理局(EMA)生物分析方法標準[15]的要求。

柱溫對各化合物的色譜響應值雖無明顯影響,但對5-HT的色譜保留時間有顯著影響。5-HT的色譜保留時間隨柱溫的微小變化而變化,且溫度越高,保留時間越長。由于部分神經遞質不穩定,易于被氧化,所以色譜分離時間不宜太長。在確保良好分離度的前提下,分析時間愈短愈好,最終確定28 ℃為分析柱溫。圖2為優化色譜條件后的標準溶液色譜圖和大鼠海馬體樣品色譜圖,單個樣品分析方法時間為10 min,其中目標化合物3 min內完全出峰。

2.2 靈敏度

連續測定6次連續稀釋的標準樣品,按照3倍信噪比(S/N)計算儀器檢出限(LOD), Glu、GABA、Ach、DA和5-HT的LODs分別為0.25、0.15、0.05、0.20和0.20 μg/L。將日內精密度小于20%且其S/N大于10的最小標準品質量濃度定義為定量限(LOQ),則Glu、GABA、Ach、DA和5-HT的定量限分別為1.0、0.50、0.15、0.60和0.60 μg/L(見表2)。

表 2 檢出限、定量限、線性范圍和相關系數Table 2 LODs, LOQs, linear ranges and correlation coefficients (R2)

圖 2 (a)5種神經遞質的混合標準溶液和(b)海馬體樣品的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of five neurotransmitters in (a) a mixed standard solution and (b) a rat hippocampus sample

2.3 穩定性

圖 3 5種神經遞質色譜峰面積比值的穩定性Fig. 3 Stabilities of the chromatographic peak area ratio for five neurotransmitters Snot VC: peak area of samples without VC; Sadd VC: peak area of samples with VC.

在標準品的連續進樣中發現,DA和5-HT的標準樣品色譜峰響應隨時間變化明顯。特別是DA,一天內連續進樣后,其色譜響應下降明顯,導致標準曲線不呈線性。查閱資料[2,12]發現,DA、5-HT都容易被氧化,從而不能與氧氣共存,所以在前處理過程中應盡量避光,并簡化前處理步驟、縮短實驗時間。同位素內標的引入雖然在很大程度上解決了操作過程對定量結果產生的偏差問題,但仍無法解決由于DA、5-HT在樣品處理和分析過程中的氧化而帶來的無法準確定量問題。因此,本研究嘗試往樣品中加入強還原性的VC以拮抗氧化劑對DA、5-HT的氧化。含有VC和不含VC的質控樣品經過前處理后,在室溫條件下保存,并于第1、2、3和10天測定5種神經遞質和VC的含量。結果顯示,Glu、GABA和Ach的峰面積比值(不加入VC的樣品響應值/加入VC的樣品響應值)較為穩定,而DA和5-HT伴隨時間的增加其峰面積比值下降明顯。在第1天測定時,5-HT和DA的峰面積比值分別為79.2%和18.8%,說明在前處理過程中,不含VC的質控樣品有約20% 5-HT和80% DA被氧化(見圖3)。當缺乏VC時,第1天DA峰高已極顯著降低,第2天已下降到檢出限附近,而加入VC后,DA在第10天依然可以檢測到明顯的色譜峰(見圖4)。與DA相比,5-HT在缺乏VC的情況下,在第10天雖能被檢測到,但其峰高亦顯著低于加入VC的樣品。因此在樣品前處理過程中,VC的加入可以扮演著“被優先氧化”的角色,從而間接保護其他還原劑(DA和5-HT)不被氧化,增加了神經遞質前處理過程和儀器分析過程中樣品的穩定性。因此在前處理以及標準溶液的配制過程中,應當加入足量(>0.5 g)的VC以抗氧化。

圖 4 維生素C對多巴胺和5-羥色胺色譜峰面積穩定性的影響Fig. 4 Influence of VC on the determination stabilities of DA and 5-HT

2.4 方法精密度、加標回收率和質量控制

往稀釋5倍的大腦海馬體勻漿液中加入標準樣品,配制成4個不同水平加標樣品,每個水平設6個平行樣,測定并計算日內加標回收率和精密度。連續6天重復配制并測定,計算日間加標回收率和精密度。5種神經遞質的日內加標回收率為96.6%～118.0%,日間加標回收率為92.9%～119%,日內精密度(RSD)為0.39%～7.50%,日間精密度為1.33%～13.6%(見表3)。此外,由于實驗用的玻璃器皿均經過濃硫酸/重鉻酸鉀配成的洗液處理,且實驗用試劑均為色譜純,因此在所有空白質控樣品中均未檢出分析物。

2.5 實際應用

新生期大鼠BPA暴露結束后,取不同性別的4個濃度組的大鼠海馬體,按照1.4節前處理方法提取神經遞質并進行含量測定,結果見表4。與對照組相比,BPA暴露后,各個神經遞質的質量濃度變化呈現出性別差異和劑量依賴性。總的來講,雄性和雌性大鼠5-HT、GABA的含量呈現下降趨勢,但Ach、Glu的含量卻呈現上升趨勢,且DA的含量變化不大,這可能與不同的神經遞質負擔不同生理活動有關。有意思的是,低濃度BPA暴露后,雄性大鼠海馬體5-HT含量顯著減少,Ach、Glu含量極顯著增加,而在雌性大鼠中僅引起了5-HT含量的顯著減少;中濃度BPA暴露后并未引起雄性大鼠海馬體5種神經遞質的顯著變化,而在雌性大鼠中卻引起了5-HT、GABA含量的顯著減少和Glu含量的顯著增加。因此,不同濃度BPA暴露對大鼠海馬體神經遞質含量的影響表現出性別差異性,這和其他文獻報道[16]的結論相一致。

表 3 日內和日間加標回收率和精密度(n=6)Table 3 Intra- and inter-day spiked recoveries and precisions (n=6)

表 4 雙酚A暴露后大鼠海馬體中5種神經遞質的含量Table 4 Five neurotransmitter levels in hippocampus of the rats exposed to bisphenol A

Mann-Whitney U test, *p<0.05; **p<0.01.

3 結論

建立了同位素內標稀釋-UPLC-MS/MS同時測定大鼠海馬體5種神經遞質(Glu、GABA、Ach、DA、5-HT)的方法。該方法操作快捷、高效,無需衍生化處理,且檢出限低,線性度、方法精密度和精確度良好,能在3 min內完成5種神經遞質的同時分析。該方法已被成功應用于新生期BPA暴露后大鼠海馬體5種神經遞質含量的定量分析,為潛在的動物在體毒理研究提供了技術支撐。