多聚賴氨酸在懸浮細胞轉染中的應用

王俊婷，落繼先

山西大學 生命科學學院，山西 太原030006

細胞轉染是指將含有目的基因的片段或具有生物功能的重組基因導入細胞并使其成功表達的技術，廣泛應用于基因功能的研究。常用的轉染方法包括病毒載體法、脂質體轉染法、磷酸鈣轉染法[1]、基因顯微注射[2]和電擊轉染法[2-3]等。

一般情況下，貼壁細胞較易轉染，而懸浮細胞的轉染普遍存在轉染效率低[1,3-4]的問題。轉染懸浮細胞一般采用電擊轉染法，但通常會造成細胞活力差[5]。常用的轉染試劑脂質體性價比高，可以用于瞬時轉染和穩定轉染[1]，但其轉染懸浮細胞的效率較低，因此，脂質體在懸浮細胞轉染中的應用較少。

多聚賴氨酸能夠促進細胞貼壁生長，被廣泛用于體外細胞培養器皿的表面處理[6]。用多聚賴氨酸處理過的培養皿培養耳蝸螺旋神經細胞[7]、胎鼠頜下腺細胞[8]、人表皮細胞[9]、背根神經節[10]、骨髓基質等細胞[6]，能夠顯著提高細胞的貼附性，并保持良好的生長狀態[11]。

我們通過多聚賴氨酸包被細胞培養板，優化脂質體轉染法，檢測并鑒定過表達質粒和小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）在懸浮細胞中的轉染和表達，建立了一套利用脂質體高效轉染懸浮細胞的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

人急性T淋巴細胞白血病細胞Jurkat（Clone E6-1）和CCRF-CEM（中國科學院上海細胞庫）；多聚-D-賴氨酸（poly-D-lysine，PDL）、ECL發光液（碧云天公司）；二甲基亞砜（Sigma公司）；24孔和6孔細胞培養板（Corning公司）；脂質體2000（Invitrogen公司）；siRNA［生工生物工程（上海）股份有限公司］；研究級倒置熒光相差顯微鏡（奧林巴斯公司）；低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；CO2細胞培養箱（北京生原誠業公司）；硝酸纖維素膜（索萊寶公司）；ABL1抗體（Santa Cruz公司）；超凈工作臺（上海博訊試驗設備有限公司）；RPMI-1640（Gibco公司）；多功能酶標儀（MD公司）。

1.2 siRNA設計

針對人ABL1基因的mRNA序列設計并合成siRNA（5'-GGGUGUACCAUUACAGGAUTT-3'；5'-AUCCUGUAAUGGUACACCCTT-3'）。

1.3 PDL工作濃度的摸索

1.3.1 PDL包被細胞培養板以無菌PBS溶液稀釋PDL，設置0、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/mL共5個濃度包被24孔細胞培養板，每孔300μL，每個濃度3個重復，于4℃過夜包被。

1.3.2 細胞培養取出過夜包被的24孔細胞培養板，于超凈工作臺內吸掉PDL溶液，吹風數分鐘至完全干燥。每孔1.5×106Jurkat或CCRF-CEM細胞，重懸于500μL無雙抗完全培養基中，于恒溫CO2細胞培養箱內培養20～24 h。

1.3.3 懸浮細胞貼壁情況統計從CO2細胞培養箱中取出細胞培養板，吸除板內培養基，用PBS洗3次，于倒置相差顯微鏡下隨機選取5個視野拍照，統計分析不同濃度PDL包被下細胞相對貼壁率，確定最佳包被濃度。

1.3.4 PDL對細胞活性的影響用PBS或PDL于4℃過夜包被細胞板，加入細胞培養（同1.3.1），24 h后換液一次；次日，每孔加入10μL MTT，輕輕搖勻，放入培養箱孵育3～4 h；將板孔上清中的細胞離心，棄上清，對應板孔與離心管中各加入100μL DMSO溶解沉淀，然后把EP管中的液體加回相應孔中，搖勻，測定D570nm值。

1.4 轉染pWPXLd

用0.1 mg/mL的PDL過夜包被細胞培養板（同1.3.1），次日鋪Jurkat和CCRF-CEM細胞培養（同1.3.2），20～24 h后吸除板孔中的培養基，用PBS洗3次，用3μL脂質體2000向24孔板內轉染1μg pWPXLd質粒，6 h后換液，換液時把板孔中的液體1000 r/min離心5 min，用500μL完全培養基重懸沉淀，加回相應孔中，放入培養箱中繼續培養。24 h后用熒光顯微鏡于可見光及熒光下同時拍照，觀察綠色熒光蛋白的表達。

1.5 轉染siRNA

PDL過夜包被細胞培養板及鋪Jurkat和CCRF-CEM細胞培養（同1.4.1）。用5μL脂質體2000向6孔板內分別轉染200μmol siRNA和對照siRNA（NC），4～6 h后換液，板孔中的 液 體1000 r/min離心5 min，用2 mL完全培養基重懸沉淀，加回相應孔中，放入培養箱中繼續培養24 h后收細胞并裂解，采用Western印跡檢測對照組和實驗組中相應蛋白的表達量，選用ACTB為上樣量的內參。

2 結果

2.1 PDL最適濃度的確定

用不同濃度的PDL包被細胞培養板，統計分析各濃度下2種細胞的相對貼壁率（圖1）。0.01 mg/mL PDL顯著促進Jurkat細胞貼壁，且這種作用隨PDL濃度的增大而提高，PDL濃度達到0.1 mg/mL后繼續增加至0.5 mg/mL，促進懸浮細胞貼壁的作用并沒有隨濃度變化而顯著增加，在CCRF-CEM細胞中顯示了一致的結果，所以后續實驗采用0.1 mg/mL PDL包被細胞培養板。

2.2 PDL對細胞活性的影響

為了排除PDL對細胞活力的影響，將Jurkat和CCRF-CEM細胞分別與0.1 mg/mL PDL或等體積的PBS作用，用MTT法檢測0.1 mg/mL PDL對細胞活力的影響。結果表明，0.1 mg/mL PDL不影響Jurkat和CCRF-CEM細胞的活性（圖2）。

2.3 2種細胞轉染效率檢測

為了研究PDL引起的懸浮細胞貼壁后是否對質粒轉染有幫助，將含有綠色熒光蛋白（GFP）基因的真核表達載體pWPXLd轉染Jurkat或CCRFCEM細胞，48 h后在熒光顯微鏡下觀察，視野范圍內GFP的表達率均在90%以上（圖3），表明pWPXLd質粒成功轉染Jurkat或CCRF-CEM細胞。

2.4 siRNA轉染及干擾效率檢測

為了進一步驗證上述方法是否對siRNA轉染有效，設計合成了ABL1的siRNA，將細胞按上述方法貼壁處理后用脂質體轉染siRNA，48 h后收取轉染的細胞并裂解，Western印跡（圖4）結果表明，與對照轉染組及正常細胞相比，siRNA組能顯著干擾Jurkat和CCRF-CEM細胞內ABL1的表達。表明上述方法對siRNA轉染同樣有效。

圖1 不同濃度PDL處理后Jurkat細胞（A）和CCRF-CEM細胞（B）貼壁情況統計

3 討論

圖2 0.1 mg/mL PDL對Jurkat細胞（A）和CCRF-CEM細胞（B）活力沒有影響

圖3 轉染pWPXLd的Jurkat細胞（A）和CCRF-CEM細胞（B）轉染效率的鑒定

圖4 Jurkat細胞（A）和CCRF-CEM細胞（B）中ABL1干擾效率鑒定

懸浮細胞轉染效率較低，近年來有較多提高懸浮細胞轉染效率的方法，如改變細胞鋪板密度、限制懸浮細胞分裂[1]、纖連蛋白預處理細胞[2]，也有人嘗試改變電擊轉染條件，如控制電壓、電容、細胞狀態和緩沖液血清濃度等[5]，甚至有電擊法和脂質體轉染法的聯合使用[2]，但大都存在細胞活力差和轉染效率很難大幅度提高等問題。急性T淋巴細胞白血病是一種常見的惡性血液腫瘤疾病[12]。Jurkat[13]和CCRF-CRM[13-14]細胞均為急性T淋巴白血病細胞系，在T淋巴細胞白血病、T細胞信號[1]和病毒感染的相關研究中也被廣泛應用[15]，但這2種細胞轉染效率低，使得相關研究在一定程度上受阻。

有研究表明，明膠、纖連蛋白、殼聚糖均能促進細胞黏附。與本研究用到的多聚賴氨酸相比，明膠的作用較弱[16]，纖連蛋白處理對材料要求較高[17]，殼聚糖需要與多聚賴氨酸聯合使用才能達到較好效果[18]。此外，聚乙醇酸、多聚乳酸[19]、層黏連蛋白和轉化生長因子β[20]雖然也能促進細胞貼壁，但因處理方法繁瑣或技術要求高而應用較少。我們采用多聚賴氨酸包被細胞培養板，促進懸浮細胞貼壁生長，然后再用脂質體轉染懸浮細胞Jurkat和CCRF-CEM，該方法適用于質粒及小干擾RNA的轉染，為白血病的相關研究提供了技術手段。