芽孢桿菌dhs-330-021菌粉的制備及穩定性研究

司曉光，張曉青，杜瑾，張愛君，曹軍瑞

自然資源部 天津海水淡化與綜合利用研究所，天津300192

目前，微生物菌粉的干燥工藝主要包括噴霧干燥和真空冷凍干燥[1]。由于真空冷凍干燥技術是利用升華原理完成物料的干燥，因此物料在干燥過程中會保持較低的溫度，對于一些溫度敏感型物質的干燥具有獨特的優勢，能獲得具有較高活性的產物，但生產周期較長，產量較小，不適合規模化的生產過程[2-4]。

噴霧干燥是工業生產中最常用的一種干燥技術，能實現物料干燥的連續操作，獲得的產品呈粉末狀，粒徑均勻，操作靈活[5]。對絕大多數微生物而言，噴霧干燥過程中的瞬間高溫和干燥脫水，會損害其生物活性和生理生化特性。因此，選擇合適的保護劑，對于保持微生物的活性具有重要意義[6-8]。

根據相關文獻報道，保護劑通過改變噴霧干燥過程中的環境條件，從而減少對微生物細胞的損害[9-12]。目前，常用的保護劑主要有脫脂乳、糖類（海藻糖、β-環糊精、蔗糖等）、醇類（甘露醇等）、氨基酸類、無機鹽類等。本研究選取了最常用的4種保護劑進行研究，即脫脂乳、海藻糖、β-環糊精、谷氨酸鈉。

1 材料與方法

1.1 材料

芽孢桿菌dhs-330-021為通過分子生物學改造而成的菌株，保存于本實驗室，培養基為LB培養基。

1.2 菌株培養及菌泥制備

將試管保存的芽孢桿菌dhs-330-021菌株在LB平板上劃線培養，挑取單菌落接種于LB液體培養基中，30℃、160 r/min培養36 h，獲得菌液；菌液8000 r/min離心10 min，去除上清液獲得沉淀；用生理鹽水洗滌沉淀3次，獲得菌泥。

1.3 噴干存活率測定

采用稀釋涂布平板計數法，測定噴干前菌液的活菌數和噴干后菌粉復原至原體積后菌液的活菌數，通過下式計算噴干存活率：

1.4 菌粉活菌數測定

稱取少量噴干后的菌粉，加入9 mL生理鹽水，定容至10 mL，充分混勻，稀釋不同的梯度進行菌落計數，按下式計算菌粉活菌數：

1.5 保護劑篩選

采用BUCHI Mini Spray Dryer B-290噴霧干燥儀進行噴干保護劑的優化，選擇脫脂乳、海藻糖、β-環糊精和谷氨酸鈉作為保護劑，分別配制不同的濃度梯度進行單因素實驗，進口溫度100℃，出口溫度50～60℃，進樣速度2～4 mL/min，測定噴干菌粉的噴干存活率和菌粉活菌數。

1.6 菌粉穩定性研究

選擇最佳保護劑比例，通過噴霧干燥工藝制備菌粉，噴霧干燥操作條件為進口溫度100℃、出口溫度50～60℃、進樣速度2～4 mL/min，將菌粉于室溫貯存30、60、90、120、150和180 d，分別取樣測定活菌數。

2 結果與討論

2.1 脫脂乳優化

取離心獲得的菌粉，分別添加2%、4%、6%、8%、10%、12%和14%的脫脂乳，混合均勻，加入生理鹽水復溶后進行噴霧干燥，操作條件為進口溫度100℃、出口溫度50～60℃、進樣速度2～4 mL/min，分別測定噴干存活率和菌粉活菌數，結果如圖1。添加脫脂乳后，芽孢桿菌dhs-330-021噴干后的存活率顯著提高，添加量為10%時存活率最高，為49.8%，隨著脫脂乳添加量的增大，存活率略有下降。通過測定噴干菌粉的活菌數發現，隨著脫脂乳含量的增加，菌粉活菌數先增加后降低，最大值在10%時，活菌數為1.59×109CFU/g。根據已有報道，脫脂乳中的蛋白類在高溫下可以發生變性，從而將菌體包裹起來免受高溫損傷，提高存活率。

2.2 海藻糖優化

取離心獲得的菌粉，分別添加2%、4%、6%、8%和10%的海藻糖，混合均勻，加入生理鹽水復溶后進行噴霧干燥，操作條件為進口溫度100℃、出口溫度50～60℃、進樣速度2～4 mL/min，分別測定噴干存活率和菌粉活菌數，結果如圖2。隨著海藻糖含量的增大，芽孢桿菌dhs-330-021的噴干存活率和菌粉活菌數均呈先增加后降低的趨勢。海藻糖添加量為6%時，噴干存活率和菌粉活菌數均最大，分別為39.7%和0.97×109CFU/g。研究表明，糖類物質發揮保護作用的基團主要是羥基。在細胞脫水過程中，糖類的羥基與水進行置換，從而保護細胞膜和胞內物質免受損傷。此外，多元醇類所含的羥基也可以作為保護劑，如甘露醇、聚乙二醇、甘油等。

2.3 β-環糊精優化

取離心獲得的菌粉，分別添加5%、7%、9%、11%、13%、15%和17%的β-環糊精，混合均勻，加入生理鹽水復溶后進行噴霧干燥，操作條件為進口溫度100℃、出口溫度50～60℃、進樣速度2～4 mL/min，分別測定噴干存活率和菌粉活菌數，結果如圖3。添加β-環糊精后，芽孢桿菌dhs-330-021的存活率和活菌數均呈先增加后降低的趨勢，當添加量為13%時，噴干存活率和菌粉活菌數均達到最大值，分別為46.5%和1.31×109CFU/g。β-環糊精也稱環七糖，內部基團呈疏水性，外部的羥基具有親水性，特殊的分子結構使其成為一種具有生物相容性的輔料。此外，β-環糊精不具有吸濕性，獲得的菌粉不易吸潮，利于保存和運輸。

2.4 谷氨酸鈉優化

圖1 脫脂乳添加量對芽孢桿菌dhs-330-021活性的影響

圖2 海藻糖添加量對芽孢桿菌dhs-330-021活性的影響

圖3 β-環糊精添加量對芽孢桿菌dhs-330-021活性的影響

取離心獲得的菌粉，分別添加7%、9%、11%、13%、15%和17%的谷氨酸鈉，混合均勻，加入生理鹽水復溶后進行噴霧干燥，操作條件為進口溫度100℃、出口溫度50～60℃、進樣速度2～4 mL/min，分別測定噴干存活率和菌粉活菌數，結果如圖4。添加谷氨酸鈉后噴干存活率均能達到20%以上，添加量為15%時存活率最大，為43.7%。菌粉活菌數最大為1.03×109CFU/g，并且獲得的菌粉沒有黏壁和結塊現象，菌粉性狀較好。谷氨酸鈉可以發揮抗氧化作用，保護細胞在噴干過程中不被氧化，而且能與水結合，使菌粉保持一定的水分，維持細胞的最低生命需求。

2.5 菌粉穩定性研究

優良的菌粉不僅要有高的活菌數，而且還應具備一定的穩定性，在儲存和運輸過程中能保持活性。采用優化后的保護劑比例，對芽孢桿菌dhs-330-021進行噴霧干燥，獲得的菌粉置于室溫保存，每隔30 d測定菌粉的活菌數，結果見圖5。最初活菌數為1.38×109CFU/g，保存30 d后仍具有較高的活菌數，為1.27×109CFU/g，保存180 d后活菌數仍能達到1.03×109CFU/g，較最初活菌數仍有74.6%的存活率，可以認為該菌粉的穩定性較好。

2.6 結論

圖4 谷氨酸鈉添加量對芽孢桿菌dhs-330-021活性的影響

芽孢桿菌dhs-330-021是一株產抑藻活性物質的菌株，在有害藻華的治理中具有很大的應用前景。通過研究其噴霧干燥過程中不同保護劑的效果，選擇脫脂乳、海藻糖、β-環糊精和谷氨酸鈉作為保護劑，可明顯地提高菌粉的活菌數，延長保存時間。噴霧干燥過程中的保護劑通常由多種保護劑復配而成，這樣可以發揮各種保護劑的優勢。比如，有些大分子保護劑通過將菌體包裹起來發揮保護作用，并且能增強低分子保護劑的作用，協同發揮作用[13-15]。

噴霧干燥技術所需設備簡單，成本較低，并且具備大規模連續生產的優勢，因此是微生物及其活性產物產業化發展的方向[16-18]。本研究通過噴霧干燥工藝將芽孢桿菌dhs-330-021發酵液制成菌粉，菌粉活菌數達1.38×109CFU/g，噴干過程中菌的存活率也能達到65.9%，保存6個月后活菌數為1.03×109CFU/g，菌粉的穩定性較好。

圖5 菌粉活菌數隨時間變化曲線