一株耐低溫石油烴降解菌的分離鑒定及其降解特性

任華峰，姜天翔，成玉，張曉青，馬曉蕾，曹軍瑞

自然資源部 天津海水淡化與綜合利用研究所，天津300192

高效油污降解菌及其生物乳化劑在油污分離、去除等領域具有十分廣闊的前景，國內外在這一領域的研究十分活躍[1-5]。而低溫油污廢水的生物處理一直存在著微生物活性低、生化處理效果差等問題。低溫污水是指溫度在20℃以下、特別是8～15℃之間的污水或廢水。對于好氧石油降解菌來說，最佳石油降解溫度一般為25～35℃，低于15℃時，其生長、繁殖和代謝會受到影響，從而造成對石油的降解速率變慢[6-8]。對此，國內外學者進行了初步研究，從石油污染的海洋、土壤中篩選出多種耐低溫石油降解菌[9-13]。我國北方沿海港口水體污染嚴重，大多數污染是由油料泄露、傾倒廢油、排放油污的艙底水、清洗發動機和船甲板機械上的潤滑油所造成；并且一年中有近6個月處于低溫區，海水溫度多在15℃以下。因此，分離高效耐鹽耐冷油污降解菌并應用于低溫油污海水的生物修復治理，將為我國北方海港低溫油污海水的有效處理提供技術支持和解決方案，具有重要的現實意義。

我們從天津大港油田海岸潮汐帶底泥中分離到一株耐低溫石油降解菌DSY171，對其進行了鑒定，研究了該菌株的生長和降解特性，并初步探討了該菌株的碳源利用廣譜性，以期為耐低溫石油降解菌DSY171在低溫油污海水處理中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌種富集、分離純化和培養基組成

試驗樣品取自天津大港油田海岸潮汐帶底泥。污泥樣品按10%的接入量接種于培養基中，于10℃、160 r/min的搖床上振蕩培養15 d左右，培養基變渾濁后，再按1%的接入量轉接到新的培養基中培養15 d左右，如此重復3～5次。然后在LB平板上劃線分離，選擇不同形態特征的菌落，重新轉接至加2 g/L原油的MSB培養基中，相同條件下培養以驗證是否具有原油降解能力，培養液變混后，進一步純化，并檢測發酵液表面張力，直至得到有降解能力的純培養菌株。

試驗用原油取自大港油田，柴油為市售0號柴油，食用油為市售大豆油，機油取自天津某機械廠。

MSB培養基：大港油田原油2 g，K2HPO41 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NH4NO31 g，酵母粉0.01 g，pH7.5，dH2O 1000 mL，如配制固體培養基則加入1.5%的瓊脂。121℃滅菌30 min，用于菌株富集培養和特性試驗。

LB培養基：蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，NaCl 1 g，瓊脂1.5～2 g，pH7.0，蒸餾水100 mL。121℃滅菌30 min，用于菌株保存和培養。

1.2 細菌生長測定和生理生化指標測定

細菌生長以波長600 nm處的濁度D600nm表示。革蘭染色、碳源利用等指標測定參照文獻方法[14]進行。

1.3 16SrDNA PCR擴增和序列測定

由國家海洋局第三海洋研究所菌種保藏管理中心完成。

1.4 原油降解率的測定[15]

將活化至對數生長期的菌株DSY171LB懸液2 mL接入100 mL含0.2%原油的MSB培養液中，以不接菌種的100 mL含0.2%原油的MSB培養液作為對照，于10℃、160 r/min恒溫振蕩搖床分別培養7和10 d，采用紫外分光光度法測定。

1.5 原油降解試驗的GC-MS分析

色譜條件：色譜柱為DB-5，MS進樣口溫度300℃，進樣量1μL，進樣方式為無分流進樣，柱流量1 mL/min，載氣為He。

質譜條件：離子源為電子轟擊源（election im?pact，EI），電子能量70 eV，離子源溫度200℃，傳輸線溫度300℃，掃描方式為全掃描，掃描速率500 amu/s，掃描范圍50～500 amu。烷烴的溫度程序：初始70℃，保持5 min，然后以4℃/min的速率升至220℃，再以2℃/min的速率升至320℃，保持15 min。

1.6 發酵液表面張力測定

原油降解菌一般會代謝產生乳化劑一類的生物活性物質，以降低發酵液的表面張力，增強對原油的降解代謝能力。因此，檢測發酵液的表面張力變化可以間接反映原油降解菌的代謝活性和原油的乳化、降解情況。本試驗中發酵液表面張力測定采用山東淄博科森公司的Auto-tensi?ometer ZL-2型表面張力測定儀。

2 結果與討論

2.1 樣品的富集培養及菌種分離純化

經過6次富集馴化培養后，得到混合微生物培養液，它可以在含有2 g/L原油的MSB培養基中生長，培養過程中混合培養液的D600nm值不斷增加，說明該混合液培養物能利用原油生長。

將上述混合培養物在LB平板上劃線分離，挑取單菌落，經過復篩、純化后得到一株能以原油為碳源、能源生長的細菌菌株，編號為DSY171（圖1）。菌株DSY171為革蘭陽性長桿狀細胞，大小為0.4μm×6μm，無鞭毛，不產芽孢。在LB平板上培養7 d，菌落大小約1 mm，圓形，表面光澤，邊緣整齊，凸出，乳白色。生理生化特征試驗表明，菌株DSY171氧化酶為陰性，接觸酶為陽性；硝酸鹽還原和亞硝酸鹽還原陰性；DNA的G+C含量為62.3%，與紅球菌屬（Rhodococcussp.）的特征基本一致。擴增菌株DSY171的16S rRNA部分基因，長度為1387 bp，與同源性較高的模式菌株進行比較，構建系統發育樹，發現DSY171與R.degradans在同一分支上。結合生理生化及分子鑒定結果，初步確定菌株DSY171歸屬紅球菌屬。

2.2 菌株DSY171利用原油的生長和對原油的降解

圖1 菌株DSY171的透射電鏡照片

將DSY171菌株接種于含2 g/L原油的MSB培養基中，12℃、160 r/min搖床培養，定時取樣測定菌體生長和原油降解情況，結果見圖2，DSY171菌株對石油的降解能力基本同步于菌體的生長，其生長曲線遲緩期基本在0～4 d，這期間是原油對菌體相關降解酶進行誘導的時期，菌體生長和石油降解均不顯著；隨后進入對數期（4～7 d），約7 d達到最高菌體生長量，石油降解率同時也快速上升，達到30%以上；7～11 d進入穩定期，菌體的生長變化不大，9～11 d時降解率達到50%～60%。與國內外同類研究報道相比，也是一株非常高效的耐低溫石油降解菌[8-10,13]。

2.3 菌株DSY171生長和降解原油的最佳條件

2.3.1 最適溫度溫度是微生物生存繁殖的重要影響因子，較低溫度下微生物新陳代謝處于受抑制狀態。按1%的接種量（菌液D600nm=1.2）將處于生長對數期的菌株DSY171接種于石油質量濃度為2 g/L的MSB培養基中，在pH7.5、160 r/min條件下振蕩培養，分別考察菌株DSY171在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃的適應性。圖3為培養12 d的菌株DSY171生長和原油降解情況。菌株DSY171在低溫條件下（10℃～15℃）12 d的石油降解率顯著優于常溫條件（20℃～30℃），低溫條件下原油的降解率為60%左右，中高溫條件下原油的降解率為10%左右。但低溫條件下菌株的生長和代謝比較緩慢。

圖2 菌株DSY171的生長和石油降解

圖3 溫度對菌體生長和原油降解率的影響

2.3.2 最適初始pH值按1%的接種量（菌液D600nm=1.2）將處于生長對數期的菌株DSY171接種于石油質量濃度為2 g/L的MSB培養基中，在12℃、160 r/min條件下，進行pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的最適初始pH試驗。經過12 d的培養，初步結果表明菌株DSY171的pH適應范圍較廣，在初始pH值為6～9的范圍內均能代謝生長，但在偏堿性環境下（pH7～9）的代謝生長好于偏酸性環境（pH6～7）（圖4）。

2.4 菌株DSY171碳源利用試驗

菌株DSY171在降解原油的同時，可以產生乳化劑等活性物質，以降低發酵液的表面張力，乳化分散原油，加快代謝利用。為了檢驗DSY171菌株的底物利用范圍，以柴油、食用油、機油和正十六烷為底物，代替原油配制MSB培養基，碳源填加量為0.3%（v/v），接種DSY171菌株，最適條件下培養12 d，測定菌體生長（D600nm）及其培養液表面張力，結果見圖5。菌株在以柴油為底物的MSB培養液中生長最好，并產生乳化劑，培養液表面張力下降到40 mN/m以下；此外，菌株DSY171對食用油、機油和正十六烷也均有一定的降解能力。

圖4 pH值對菌體生長和原油降解率的影響

2.5 原油降解試驗的GC-MS檢測分析

為了進一步研究菌株DSY171對原油烴中各組分的降解情況，進行了GC-MS檢測分析。在原油含量為0.2%的MSB培養基中，菌株DSY171在10℃、160 r/min的條件下培養12 d，將MSB培養液中的原油用正己烷萃取進行GC-MS檢測分析，結果見圖6。與對照相比，菌株DSY171對原油烴各組分的降解效果非常顯著，大部分烴組分甚至被完全降解，說明在本試驗條件下，菌株DSY171對原油中中長鏈烷烴具有良好的降解能力。

綜上，耐低溫石油降解菌DSY171的分離及其降解特性的研究，為生物學方法解決低溫環境石油污染問題提供了高效菌種，在環境微生物學理論研究和實踐應用中具有一定的意義和價值。后續，將對其生物乳化劑的組成和結構，以及處理模擬低溫油污海水進行深入研究。

圖5 菌株DSY171對柴油等不同碳源的利用

圖6 DSY171降解樣品中原油烴組分的GC-MS譜圖