一種狂犬病毒疫苗佐劑的制備及其免疫效果研究

李宗霖，蘇敏，劉澤，楊卉娟，靳瑋華，廖國陽

1.中國醫學科學院北京協和醫學院 醫學生物學研究所，云南 昆明650018；

2.云南省第一人民醫院 檢驗科，云南 昆明650032

狂犬病是由彈狀病毒科狂犬病毒屬中的負鏈RNA病毒感染中樞神經系統，導致神經腦脊髓炎的一種致死率接近100%的人畜共患病。狂犬疫苗價格昂貴，免疫程序復雜，成為巨大的公共衛生負擔。每年全世界有40 000～70 000人死于狂犬病，其中99%以上發生在發展中國家，主要是非洲和亞洲[1]。在中國大陸，從1950年到2004年，有103 200人死于狂犬病；僅在2007年，我國總病例數為3302[2]。狂犬病嚴重威脅著人民群眾的生命安全，而狂犬疫苗的使用能夠很好地預防和控制狂犬病。但是，目前市售的狂犬病疫苗是不含佐劑的滅活疫苗，免疫原性較低，通常需要免疫4～5次以進行暴露后預防，這增加了疫苗接種的成本，并且可能由于不完全疫苗接種而導致免疫失敗[3]。

細菌鞭毛蛋白是鞭毛絲的結構組成部分，可以自己組裝成蛋白亞基，排列成螺旋狀，形成中空的管狀結構。鞭毛蛋白應用于疫苗佐劑的突出優點在于，其作為Toll樣受體5（TLR5）的配體被識別，活化NF-κB信號通路，促進腫瘤壞死因子α（TNF-α）白細胞介素6（IL-6）等細胞因子的產生，在機體免疫系統中發揮佐劑功能[4]。鞭毛蛋白佐劑已應用于鞭毛蛋白-流感病毒血凝素（HA）表位、鞭毛蛋白-卵清白蛋白（OVA）、鞭毛蛋白-破傷風類毒素等疫苗中[5]。Qi[6]等研究發現，表達鞭毛蛋白的狂犬重組病毒樣顆粒在小鼠動物模型中增強了體液免疫和細胞免疫。

在本研究中,我們將角鯊烯、山梨醇和吐溫在琥珀酸緩沖液中制備成“水包油”乳顆粒，再聯合甲型副傷寒沙門菌鞭毛蛋白制備成復合佐劑Na?no-fla，將其應用于人二倍體狂犬病疫苗，接種BALB/c小鼠，研究其體液免疫和細胞免疫應答,初步驗證了其作為狂犬病毒疫苗佐劑的安全性和有效性。

1 材料和方法

1.1 材料

6～8周齡BALB/c雌性小鼠（體重12～14 g）由中國醫學科學院醫學生物學研究所小動物實驗中心提供。動物實驗依據北京協和醫學院實驗動物倫理和使用指南（DWLL201605024）進行。

BHK-21細胞來自中國醫學科學院醫學生物學研究所；狂犬病毒CVS-11攻毒株來自中國食品藥品檢定研究院；抗狂犬血清標準品購自中國食品藥品檢定研究院。均由中國醫學科學院醫學生物學研究所生物制品五室保存。

人二倍體細胞狂犬病疫苗（KMB17細胞）由中國醫學科學院醫學生物學研究所提供，批號為20170630。佐劑配方為4.3%角鯊烯、0.5%吐溫80、0.5%司盤80，緩沖液為琥珀酸溶液（10 mmol/L，pH6.5），經高壓均質機（APV2000，AVP Sys?tems Laboratory）混合制備成水包油乳液，再與鞭毛蛋白充分混合，鞭毛蛋白終濃度為100μg/mL。

抗狂犬核蛋白抗體（FITC標記）購自Biorbyt公司；IgG ELISA試劑 盒 購自Alpha Diagnostic公司；ELISPOT試劑購自Mabtech公司；角鯊烯、吐溫80、司盤80購自Sigma公司；甲型副傷寒沙門菌鞭毛蛋白由上海生工生物工程有限公司合成；M199、RPMI1640培養基和小牛血清購自Gibco公司；MEM培養基和PBS（pH7.4）由中國醫學科學院醫學生物學研究所溶液組提供。

1.2 免疫方案

將小鼠隨機分為PBS對照組、全劑量疫苗組、半劑量疫苗組、低劑量佐劑組、中等劑量佐劑組，每組24只。各組小鼠采取腿部肌肉注射方式免疫，免疫劑量為200μL/只，免疫時間為第0、3、7 d，于首針免疫后第7、14 d尾靜脈采血，分離血清，-80℃保存。全劑量疫苗組為200μL二倍體狂犬疫苗，中等劑量佐劑組為100μL佐劑混合100μL疫苗，低劑量佐劑組為50μL佐劑加入50μL MEM和100μL疫苗混合。

1.3 CVS-11病毒滴定

毒種用MEM做1/3系列稀釋，每個稀釋度3個復孔，每個稀釋度取100μL加入96孔培養板，加入BHK-21細胞50μL/孔（1×106/mL），在5%CO2培養箱中37℃培養24 h。之后吸棄上清，用80%丙酮固定細胞，加入FITC熒光標記的狂犬病毒核蛋白抗體，使80%細胞被感染的病毒最高稀釋度作為中和用病毒稀釋度。

1.4 佐劑對狂犬病疫苗體液免疫的影響

1.4.1 快速免疫熒光灶抑制試驗根據《中國藥典》（2015版）的檢測指南[7]，采用快速免疫熒光灶抑制試驗（RFFIT）檢測小鼠血清樣品的中和抗體水平。待測血清試驗前56℃滅活30 min，1/3系列稀釋，每個稀釋度取0.1 mL加入96孔板，每孔加入0.1 mL能致80%細胞被感染的中和病毒懸液，在含5% CO2的培養箱中37℃孵育60 min；用0.125%胰酶消化BHK-21細胞，用含10%小牛血清的MEM培養液制備1×105/100μL的細胞懸液加入板中，每孔50μL，37℃培養24 h；吸棄上清后PBS洗板3次，加入80%丙酮，50μL/孔，-20℃放置10 min，吸棄丙酮讓各孔干燥，加入帶FITC熒光標記的狂犬病毒核蛋白抗體50μL/孔，濕盒內放置30 min；PBS洗板，在倒置顯微鏡下觀察樣品孔與標準品血清對照孔的熒光灶數量，計算96孔板中的熒光焦點數（NFF）；計算焦點形成單位（FFU）（FFU=NFF×稀釋率）。來自中國食品藥品檢定研究院的標準血清滴度為200 IU/mL，抗體滴度=（標準血清的LgED50/實驗血清的LgED50）×200 IU/mL。

1.4.2 ELISA檢測IgG抗體ELISA方法檢測首次免疫后14 d小鼠血清中的IgG水平，操作步驟依照IgG ELISA試劑盒說明書。

1.5 佐劑對狂犬病疫苗細胞免疫的影響

首針免疫后14 d頸椎脫臼法處死小鼠，體表消毒后解剖小鼠腹部，將分離得到的脾臟組織浸泡在PBS溶液中，用40μm細胞篩和紅細胞裂解液處理后400 r/min離心15 min，去除上清，加入含20%小牛血清的1640培養液重懸；細胞計數后以1640培養液為稀釋液制備密度為5×106/mL的脾淋巴細胞懸液，在預先包被γ干擾素（IFN-γ）/白介素4（IL-4）抗體的96孔板每孔中加入100 μL細胞懸液，每孔含106細胞，加入10μL狂犬疫苗作為刺激物，將96孔板在含5% CO2的培養箱中37℃溫育36 h；加入二抗，室溫作用1 h，PBS洗板后加入HRP標記的酶；加入顯色劑，用Spot Reader B1（SLT Instruments）讀數分析。稀釋抗體和洗滌處理96孔板等步驟參照ELISPOT試劑盒說明書。

1.6 攻毒保護實驗

分別設置PBS對照組、全劑量疫苗組、半劑量疫苗組、低劑量佐劑組、中等劑量佐劑組，每組16只雌性BALB/c小鼠，于第0、7 d分別腹腔注射0.5 mL/只。小鼠于第一次免疫后14 d顱內注射預先滴定的50LD50的CVS-11病毒，每只0.03 mL。連續觀察14 d，記錄死亡情況，統計第5 d后死亡的和呈典型狂犬病腦癥的小鼠數量，計算存活率。觀察各實驗組小鼠是否有蜷縮、豎毛、抽搐、痙攣等異常狀況，以及小鼠的進食、排泄、精神表現等狀況，每24 h記錄一次小鼠體重。

1.7 統計學分析

用SPSS17.0軟件進行統計學分析，用Graph?Pad Prism 6.0軟件繪制圖表。組間比較采用方差分析和t檢驗，所有分析中差異的顯著性表示為*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001。

2 結果

2.1 體液免疫

免疫熒光灶抑制試驗結果顯示首針免疫后第7 d中等劑量佐劑組的中和抗體達保護效力水平（中和抗體濃度≥0.5 IU/mL），而全劑量疫苗組和低劑量佐劑組的中和抗體水平在第7 d皆未達到保護水平（中和抗體濃度≤0.5 IU/mL）。第14 d時，全劑量疫苗組、中等劑量佐劑組、低劑量佐劑組的中和抗體均達到保護水平（中和抗體濃度≥0.5 IU/mL），而中等劑量佐劑組的中和抗體滴度顯著高于全劑量疫苗對照組（P＜0.0001），低劑量佐劑組的中和抗體為1.08 IU/mL，與全劑量疫苗組的中和抗體滴度（1.17 IU/ml）沒有明顯差異（P＞0.05），第14 d時中等劑量佐劑組的IgG抗體濃度顯著高于全劑量疫苗對照組（P＜0.0001）。上述結果提示本研究中的佐劑在中等劑量下可誘導狂犬病疫苗更快地產生中和抗體，并且在減少一半抗原劑量的情況下中和抗體滴度仍然高于全劑量疫苗對照組。結果見圖1。

2.2 細胞免疫

為了進一步探索小鼠誘導的細胞免疫應答，我們采用ELISPOT法檢測初次免疫后14 d IFNγ和IL-4的分泌水平。如圖2A所示，中等劑量佐劑組與全劑量疫苗組相比，分泌IFN-γ的淋巴細胞數量增加了約3倍（P＜0.05）；分泌IL-4的淋巴細胞數量較全劑量疫苗組也顯著增加（P＜0.0001）（圖2B）。上述結果表明在抗原用量減少一半的情況下，中等劑量佐劑增強小鼠脾細胞的IFN-γ和IL-4分泌能力。

2.3 免疫保護試驗

如圖3A，PBS對照組、半劑量疫苗組和低劑量佐劑組的小鼠體重明顯減輕。PBS對照組在攻毒第7 d開始出現臨床癥狀，表現為毛亂、蜷縮、極度興奮等，第8～12 d逐漸死亡。半劑量疫苗組和低劑量佐劑組中均有不同程度的體重減輕，部分小鼠在第8～15 d死亡。全劑量疫苗組和中等劑量佐劑組小鼠體重未見異常，且未出現蜷縮、狂躁、毛亂等狂犬病毒感染癥狀。如圖3B所示，低劑量佐劑組（75%）和中等劑量佐劑組（100%）比半劑量疫苗組（25%）和PBS對照組（0%）有著更高的存活率，這表明中等劑量的佐劑在減少一半抗原劑量的情況下仍然具有保護效力。

圖1 各組小鼠特異性抗體應答

圖2 初次免疫后第14 d細胞免疫效果

圖3 攻毒后BALAB/c小鼠體重變化和生存率

3 討論

鞭毛蛋白可通過化學方法合成，易于質控達到GMP的標準，作為一種TLR5刺激劑在多種疫苗中可提高疫苗的免疫原性[5]。狂犬病毒是一種嗜神經病毒，一旦侵染神經系統，致死率接近100%，在暴露后免疫便需要更快地產生保護性抗體（中和抗體滴度≥0.5 IU/mL）。在本研究中，中等劑量佐劑組在第7 d中和抗體達到了1.16 IU/mL），顯著高于全劑量疫苗組，在節約一半劑量的同時仍達到了保護性水平。有研究發現，干擾素在抗狂犬病毒中發揮重要作用[8-9]，以IFN為佐劑的狂犬病疫苗誘導的淋巴細胞轉化率顯著高于佐劑組，對體液免疫和細胞免疫有更強的刺激作用。南京市傳染病醫院和衛生部長春生物制品研究所的案例表明，狂犬病毒暴露后的注射中添加一劑干擾素的13 000多例中無一免疫失敗；在4起狂犬集中咬傷案例中，33例干擾素注射均無一例失敗，相比之下常規注射的10例里出現了4例死亡。在Nano-fla復合佐劑的刺激下，中等劑量佐劑+半劑量疫苗組分泌IFN-γ的淋巴細胞數量較全劑量疫苗組增加了約3倍。干擾素具有廣譜抗病毒作用和一系列細胞免疫調節功能，可以限制狂犬病毒在局部細胞中的繁殖，避免其擴散至中樞神經系統。最近一種名為皮卡（PIKA）的狂犬疫苗佐劑進入臨床試驗[10]，顯示出良好的保護效果。皮卡佐劑作用下，小鼠脾淋巴細胞經刺激后IFN-γ水平增高，且攻毒后的保護效果皆優于無佐劑組[11]。類似結果在本研究中也有體現，在Nano-fla復合佐劑刺激下，中等劑量佐劑組分泌IFN-γ的淋巴細胞數量較全劑量疫苗組增加了約3倍，同時中等劑量佐劑組和低劑量佐劑組的生存率皆高于半劑量疫苗組。綜上，本研究制備的復合佐劑Nano-fla在小鼠模型中體現了對狂犬病疫苗的體液免疫和細胞免疫的增強效果，在降低抗原用量的同時仍能較快產生中和抗體，安全性良好，有望開發為新型狂犬病疫苗佐劑。