尼古丁在誘導的肺泡巨噬細胞自噬及肺炎中的作用

吳菲，靳輸梅，李曉艷，邱煒，楊國菊，張婷娟，齊家龍，繆嬌麗，趙紅宇

1.云南省第三人民醫院，云南 昆明650000；2.云南省藥物研究所，云南白藥集團創新研發中心，云南省中藥和民族藥新藥創制企業重點實驗室，云南 昆明650000；3.中國醫學科學院北京協和醫學院 醫學生物學研究所，云南 昆明650000；4.云南省華寧縣人民醫院，云南 昆明650000

吸煙是慢性阻塞性肺病[1]、動脈粥樣硬化[2]和心血管疾病[3]的主要危險因素。尼古丁是香煙煙霧中的主要成分之一，是N膽堿受體激動劑，會使人上癮并產生依賴性[4]。研究表明香煙煙霧提取物能夠誘導肺動脈內皮細胞凋亡，從而形成肺動脈高壓[5]。尼古丁通過激活NLRP3炎癥小體，誘導人主動脈內皮細胞凋亡，促進動脈粥樣硬化發生[6]。尼古丁能夠誘導人牙周膜細胞自噬，參與牙周炎的發生發展過程[7]。同時，尼古丁可以誘導中性粒細胞產生中性粒細胞外捕獲網[8]，與吸煙相關的疾病息息相關[9]。

細胞自噬是一種機體自我保護的程序性死亡，是真核細胞通過降解途徑維持細胞的穩態，在人體生理中起重要作用，尤其是在抗微生物感染、衰老和神經退行性疾病方面[10]。通過多種方式誘導細胞自噬，也是抗癌治療的一種手段[11]。與此同時，細胞自噬在先天免疫中也發揮重要作用，宿主可以通過自噬-溶酶體降解途徑保護機體免受細菌感染[12]，如結合分枝桿菌、沙門菌及土拉弗朗西斯菌等。先天免疫細胞中，尤為重要的是中性粒細胞和單核細胞，其在抗微生物感染方面起到了重要的作用[13]。

尼古丁可以誘導多種細胞凋亡和自噬的發生，而尼古丁與巨噬細胞吞噬功能和肺炎的關系尚無文獻報道。本研究旨在探討尼古丁與巨噬細胞的功能和肺炎發生的關系，結果表明自噬能夠誘導肺泡巨噬細胞MH-S發生自噬并且呈劑量依賴性，尼古丁處理能夠增強LC3BⅡ的表達，通過電鏡觀察也能看到大量自噬體的出現。中性紅吞噬實驗表明，尼古丁誘導了巨噬細胞的自噬，影響了巨噬細胞的吞噬功能。小鼠體內實驗表明，尼古丁可以誘導肺部炎癥的發生。本研究通過體內外實驗驗證了尼古丁誘導肺泡巨噬細胞的自噬以及肺炎的關系，為探討香煙煙霧暴露對肺相關疾病的機制研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司，飼養于SPF級動物房內，本實驗遵循《實驗動物保護條例》；肺泡巨噬細胞系MH-S購自昆明泉港生物科技有限公司。

戊二醛、牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma公司；Hoechst33258、碘化丙啶（PI）、中性紅粉末、H&E染色試劑盒、RIPA細胞裂解液、TC處理細胞爬片及TMB單組分顯色液購自北京索萊寶科技有限公司；PBS、胎牛血清（FBS）、RPMI1640培養基購自BI公司；IL-6、IL-1、TNF-α配對抗體購自eBioscience公司；抗LC3B抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG購自Abcam公司；ECL化學發光底物購自Thermofish公司。

1.2 細胞培養及處理

MH-S細胞用含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素、1%非必需氨基酸的RPMI-1640培養基培養于37℃恒溫培養箱中，調整細胞狀態并將對數生長期的細胞于實驗前1 d以1×106/孔的密度鋪板。

1.3 尼古丁處理

用無菌的PBS溶解尼古丁粉末，制備1 mmol/L尼古丁母液，用0.22μm的小濾器過濾除菌備用，分別用不同濃度的尼古丁緩沖液處理細胞。

1.4 Hoechst33258/PI雙染免疫熒光檢測

用無抗的RPMI1640培養基對24孔板的MHS細胞進行換液，采用不同濃度的尼古丁進行處理，6 h后去除上清，用無菌PBS清洗3次。用含10μg/mL Hoechst33258/PI的完全RPMI1640培養基染色15 min，在熒光顯微鏡下觀察和攝片。

1.5 Western印跡檢測細胞自噬

細胞經處理后，用無菌PBS清洗3次，用100 μL含有蛋白酶和磷酸化酶抑制劑的RIPA裂解液提取每孔蛋白，采用Bradford法測定蛋白濃度并制備蛋白電泳樣品；按濃縮膠80 V 30 min、分離膠120 V 60 min進行SDS-PAGE，半干法轉膜，將含有蛋白的PVDF膜置于5%脫脂奶中37℃封閉2 h，并加入抗LC3B（1∶3000）抗體，4℃封閉過夜，1×TBST清洗5次，每次5 min；加入HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶5000），37℃孵育90 min，1×TBST清洗5次，每次5 min；于成像儀上用ECL化學發光試劑顯影，采用Image J軟件分析。所有實驗重復3次。

1.6 透射電子顯微鏡觀察細胞自噬

將1×106MH-S細胞接種于12孔板，用10 μmol/L尼古丁刺激6 h，去除上清，PBS清洗3次，收集細胞，12 000 r/min離心10 min，緩慢去除上清，用200μL 4℃預冷的戊二醛固定細胞，進行細胞切片，在電子顯微鏡下觀察細胞自噬體的情況并統計分析。

1.7 中性紅吞噬實驗

細胞經過處理后，用PBS清洗3次，加入500 μL 0.22μm過濾器過濾的0.05%中性紅溶液，染色5 min，期間觀察細胞的狀態，保證細胞的活性。染色完成后，用PBS清洗3次，將細胞外的中性紅溶液清洗干凈。加入500μL中性紅提取液（50%乙醇+1%乙酸+49%水）提取MH-S攝取的中性紅，12 000 r/min離心10 min，用分光光度計測定D540nm值，換算中性紅的攝取能力。

1.8 HE病理染色及分析

BALB/c小鼠分為對照組及攻毒組（尼古丁），每組5只。用尼古丁滴鼻，觀察小鼠肺損傷情況，每2 d滴鼻1次，持續1周。操作前監測小鼠體重變化，2周后處死小鼠，取小鼠左肺用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，用H&E染色試劑盒染色，顯微鏡下觀察、攝片，用Image J統計分析。

1.9 統計方法

用GraphPad Prism 7.0做圖和數據統計分析，所有實驗重復3次，計量數據用x±SD表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 尼古丁誘導MH-S細胞死亡

香煙煙霧提取物可以誘導肺動脈內皮細胞、人牙周膜細胞、心肌細胞死亡。用Hoechst33258/PI雙染色檢測尼古丁誘導肺泡巨噬細胞的死亡情況，MH-S細胞分別用10、1、0.1μmol/L的尼古丁處理6 h，結果如圖1。隨著尼古丁劑量的增加，PI染色的死細胞數呈梯度依賴趨勢，10 μmol/L尼古丁處理6 h后，大部分細胞呈死亡狀態，因此采用1μmol/L尼古丁為后續實驗的工作濃度。

2.2 尼古丁誘導細胞自噬發生

細胞自噬是一種程序性的細胞死亡，研究表明，細胞自噬的發生與尼古丁的攝取密切相關。Western印跡結果顯示，隨著尼古丁濃度的升高，LC3BⅡ表達水平顯著升高，差異具有統計學意義（P＜0.05），且升高趨勢在尼古丁濃度為10μmol/L是有所降低，可能因部分細胞已經死亡所致。并且發現，尼古丁能夠明顯增強用LPS預處理的MH-S細胞自噬。同時采用1μmol/L尼古丁處理MH-S細胞6 h后用透射電子顯微鏡觀察，實驗組的自噬體數量明顯高于對照組，Image J統計分析，結果具有統計學意義（P＜0.05）。表明尼古丁能夠增強細胞自噬的發生。參見圖2。

2.3 尼古丁降低巨噬細胞的吞噬能力

吞噬能力是巨噬細胞殺菌、抗病毒感染以及清除衰老壞死細胞組織最重要的環節之一。通過中性紅吞噬實驗檢測尼古丁處理后MH-S細胞的吞噬能力，結果如圖3。尼古丁作用6 h后，MH-S的吞噬能力呈劑量依賴的降低趨勢，結果具有統計學意義，說明尼古丁能夠明顯降低巨噬細胞的吞噬能力。

2.4 尼古丁誘導肺損傷發生

用尼古丁進行小鼠鼻腔攻毒，每次50μL，劑量為10μmol/只，每2 d滴鼻1次，連續1周，同時檢測小鼠體重，結果如圖4A，與對照組相比，小鼠體重呈下降趨勢，停止攻毒后小鼠體重恢復。取攻毒組和對照組左肺進行H&E染色（圖4B），可以明顯看到攻毒組肺部有大量炎性細胞浸潤，表明尼古丁能夠造成小鼠肺炎的發生。

3 討論

吸煙是糖尿病、心血管疾病、肺部相關疾病等的重要危險因素[14]。吸煙可以引發心肌細胞、肺動脈內皮細胞凋亡和自噬，香煙煙霧中最豐富和重要的成分就是尼古丁，研究表明尼古丁也會促進多種細胞自噬發生并誘發肺相關疾病[5]。中性粒細胞和單核細胞是機體重要的先天免疫細胞，已有研究表明尼古丁可以誘導中性粒細胞產生中性粒細胞捕獲網狀態[9]，這個過程依賴于自噬的發生[15]。本研究也表明尼古丁可以誘導巨噬細胞死亡，核酸染料PI不能穿透完整的細胞膜，而可以對壞死細胞染色。

巨噬細胞作為宿主抵抗病原微生物的第一道防線，吞噬能力是其發揮功能的重要方面[16]。傳統意義上，細胞自噬的發生是細胞自潔過程，不僅對胞內菌有作用，對胞外微生物也有應答，但異常的自噬發生也會導致細胞死亡[13]。本研究發現外源尼古丁能夠誘導肺泡巨噬細胞產生細胞自噬的現象，通過Western印跡檢測LC3BⅡ的表達及透射電子顯微鏡觀察自噬體的數目均能表明自噬的發生。這種異常自噬不僅導致了巨噬細胞死亡，同時影響了巨噬細胞的吞噬功能，如中性紅吞噬實驗所示。并且本研究還發現，尼古丁誘導的自噬在LPS刺激下更加嚴重，表明吸煙攝入的尼古丁有可能加重感染所導致的肺炎。

吸煙也是慢性阻塞性肺病最重要的誘因之一[17]。慢性阻塞性肺病是一種氣流阻塞特征的慢性支氣管炎和（或）肺氣腫，可進一步發展為肺心病和呼吸衰竭[17]。肺炎為慢性阻塞性肺病急性加重的重要誘因，慢性阻塞性肺病氣流受限不可逆，肺炎患者長期慢性感染加重后可導致慢性阻塞性肺病。慢性阻塞性肺病急性加重期常伴發肺部感染。本研究表明，尼古丁能有效地誘導小鼠發生肺炎。

本研究表明，尼古丁能夠有效地增強巨噬細胞細胞死亡，這種死亡過程伴隨著自噬的發生，并且能夠被LPS預刺激加強。與此同時，尼古丁引起的巨噬細胞自噬降低了細胞吞噬能力，這有可能抑制了宿主清除病原菌的能力。最后，本研究表明在體內表面，尼古丁能引起小鼠發生肺炎癥狀。總之，本研究為進一步探討吸煙相關肺部疾病的發病機制和治療方法提供了依據。

圖2 尼古丁誘導細胞自噬的發生

圖3 尼古丁降低巨噬細胞吞噬能力

圖4 尼古丁誘導小鼠肺炎發生