TRAF6調控NLRP3炎癥小體信號通路的機制研究

于敏，朱占芳，劉飛，楊瑾，王英

西安交通大學 醫院，陜西 西安710049

炎癥反應是機體應對刺激時的一種保護性免疫反應。機體產生的炎癥反應太弱就不能及時、有效地清除病原微生物，會導致持續性感染；而炎癥反應過強則會誘發炎癥相關疾病[1]，已經證實炎癥參與多種炎癥相關疾病如2型糖尿病[2]、痛風[3]、腫瘤[4]等的發生發展。因此，機體內存在嚴密的機制調控炎癥反應的整個過程。

病原體的病原相關分子模式（pathogen-asso?ciated molecular patterns，PAMP）和機體釋放的損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMP）均能通過機體內的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRR）或感應系統啟動天然免疫系統、激活炎癥反應。常見的PAMP包括脂多糖、肽聚糖、鞭毛蛋白以及一些微生物的核酸分子等，這些PAMP能夠被相應的PRR識別進而激活下游信號通路，引起炎癥反應或抗菌應答[5]。已知的PRR主要包括三類：Toll樣受體、RIG-Ⅰ樣受體和NOD樣受體（NOD like recep?tors，NLR）。其中NLR是定位于胞漿中廣泛表達的模式識別受體家族，在受到PAMP和DAMP的刺激時，一些NLR可以和凋亡相關顆粒樣蛋白（apoptosis associated speck-like protein，ASC）、天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶（caspase-1）形成一種被稱作炎癥小體的多聚蛋白復合物，進而激活下游信號通路，引起炎癥反應。NLRP3（NLR pyrin domain-3）是NLR家族中研究最為深入的一個[6]，其被證實參與多種炎癥相關疾病的發生發展。迄今，關于NLRP3炎癥小體信號通路的調控機制還有很多未知問題有待探索。因此，研究機體對NLRP3炎癥小體信號通路的調控具有重要意義。

腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）是細胞內信號轉導通路上的關鍵接頭蛋白，能直接或間接地與腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族和（或）白介素1（interleu?kin-1，IL-1）/Toll樣受體超家族成員結合，通過轉錄因子NF-κB、JNK/p38、（PI3K）/AKT、AP-1通路的激活，影響細胞的生成、增殖、分化和死亡，調控先天性和獲得性免疫、炎癥反應、胚胎發育、氧化應激、骨代謝等多個生物學過程[8-9]。目前關于TRAF6對NLRP3炎癥小體信號通路調控的報道還很少。本研究揭示了TRAF6通過增加NLRP3的穩定性，正調控NLRP3炎癥小體信號通路的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚胎腎細胞HEK-293T和人單核巨噬細胞THP-1，真核表達質粒Myc-Vector、Myc-TRAF6、Myc-NLRP3、Flag-Vector、Flag-TRAF6和Flag-NL?RP3為西安交大醫學部保存；Myc標簽抗體、Flag標簽抗體、α-tubulin抗體、TRAF6抗體購自Abcam公司；HRP標記的羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋生物有限公司；siTRAF6序列和作為對照的siS?cramble序 列（5'-GTGCAAGTGCAAACCAGACTT-3'）購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；Flag標簽抗體偶聯的瓊脂糖珠、Myc標簽抗體偶聯的磁珠、脂多糖（LPS）、腺苷三磷酸（ATP）購自Sigma公司；轉染試劑jetPRIME購自PolyPlus公司；培養基和血清購自Gibco公司；聚偏二氟乙烯膜（PVDF）、顯影液購自Millipore公司；乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物公司；細胞培養箱產自Thermo公司；蛋白質電泳槽和電源產自Bio-Rad公司；旋轉孵育儀產自江蘇海門儀器廠；離心機產自Eppendorf公司；半干轉膜儀和化學發光拍照系統產自天能生物技術公司；酶標儀產自Perkin Elmer公司。

1.2 細胞培養及轉染

用含10%胎牛血清、100 mmol/L鏈霉素、100 mmol/L青霉素的DMEM培養基，于37℃、5% CO2培養箱中培養HEK-293T細胞；用含10%胎牛血清、100 mmol/L鏈霉素、100 mmol/L青霉素的1640培養基，于37℃、5% CO2培養箱中培養THP-1細胞。用轉染試劑jetPRIME進行轉染，取細胞培養基1/10量的轉染試劑緩沖液，向緩沖液中加入待轉染質粒后漩渦混勻15 s，靜置10 min后加入jetPRIME轉染試劑再漩渦混勻15 s，室溫靜置15 min后將配好的轉染液加入提前半量換液的細胞培養基中，4～6 h后補充新鮮的培養基，轉染24 h后細胞進行后續處理。

1.3 免疫共沉淀

用細胞刮子刮取細胞，4℃、3000 r/min離心5 min收集細胞，再用預冷的PBS清洗細胞3次，加入600μL NP40裂解液重懸細胞，冰上靜置20 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清。取上清的1/10用于檢測全細胞蛋白，剩余部分各加入20μL Flag瓊脂糖珠子，4℃旋轉搖床上孵育2 h，4℃、3000 r/min離心3 min，棄上清，沉淀用NP40洗脫液清洗3次，得到的沉淀和之前取出的1/10上清分別加入50μL含巰基乙醇的4×SDS緩沖液，沸水中煮10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，進行免疫印跡分析。

1.4 免疫印跡

用細胞刮子刮取細胞，4℃、3000 r/min離心5 min收集細胞，再用預冷的PBS清洗細胞3次，用1×PBS重懸細胞，再加入含巰基乙醇的4×SDS緩沖液混勻，沸水煮10 min后12 000 r/min離心10 min，取上清進行SDS-PAGE，半干轉膜儀18 V、100 min將凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜上，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，封閉完畢后孵育一抗（室溫1 h），TBST洗滌3次，每次5 min，孵育二抗（室溫1 h），TBST洗滌3次，每次5 min，化學發光顯影。

1.5 LDH檢測

用碧云天生物公司的乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒檢測細胞釋放的LDH。

1.6 統計學分析

數據以x±s表示，用SPSS17.0軟件對數據進行重復測量資料的方差分析，組間數據比較采用Dunnettt檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TRAF6與NLRP3相互作用

為了研究TRAF6與NLRP3是否存在相互作用，我們將Myc-TRAF6分別與Flag-Vector和Flag-NLRP3共轉染HEK-293T細胞，用Flag珠子進行免疫共沉淀，結果顯示Flag-NLRP3的免疫沉淀復合物中含有Myc-TRAF6，而Flag-Vector的免疫沉淀復合物中不含Myc-TRAF6（圖1A）。為了進一步驗證TRAF6與NLRP3的相互作用，排除Myc-TRAF6與Flag珠子發生非特異結合的可能性，再次將Flag-NLRP3分別與Myc-Vector和Myc-TRAF6共 轉染HEK-293T細胞，用Myc珠子 進行免疫共沉淀，結果顯示Myc-TRAF6的免疫沉淀復合物中含有Flag-NLRP3，而Myc-Vector的免疫沉淀復合物中不含Flag-NLRP3（圖1B）。上述結果說明TRAF6能夠與NLRP3相互作用。

2.2 TRAF6增加NLRP3的蛋白穩定性

TRAF6能夠與NLRP3相互作用，接下來我們研究TRAF6對NLRP3蛋白穩定性的影響。將不同劑量的Myc-TRAF6分別與Flag-NLRP3共轉染HEK-293T細胞，進行免疫印跡檢測，結果顯示轉染不同量Myc-TRAF6的實驗組中Myc-TRAF6的表達量確實存在差異，而且表達量隨著轉染量的增加而增加，證明本實驗使用的轉染體系的高效性。同時，Myc-TRAF6能夠使Flag-NLRP3蛋白水平顯著增加（圖2），而且Flag-NLRP3的蛋白水平隨Myc-TRAF6蛋白水平的升高而逐步升高，這說明TRAF6對NLRP3具有正調控作用。

2.3 TRAF6促進NLRP3炎癥小體介導的LDH釋放

如上，TRAF6能夠與NLRP3相互作用并上調NLRP3的蛋白穩定性，因此進一步研究TRAF6對NLRP3炎癥小體信號通路的影響。首先檢測TRAF6小干擾RNA（siRNA）序列在THP-1細胞中的干擾效率。將TRAF6 siRNA序列和作為對照的siScramble序列分別轉染THP-1細胞，收取細胞進行免疫印跡實驗，檢測TRAF6的表達，結果顯示轉染TRAF6 siRNA序列的實驗組THP-1細胞中TRAF6蛋白表達水平明顯低于轉染siScram?ble序列的對照組（圖3A），說明該TRAF6 siRNA序列可有效敲低THP-1細胞中的TRAF6。隨后進行NLRP3炎癥小體介導的LDH釋放的研究。先將TRAF6 siRNA序列和siScramble序列分別轉染THP-1細胞，然后同時加入刺激物LPS，接著再同時加入刺激物ATP，刺激一段時間后檢測LDH的釋放。結果顯示，轉染TRAF6 siRNA序列的實驗組THP-1細胞中LDH的釋放量明顯低于轉染siScramble序列的對照組（圖3B），說明TRAF6能夠促進NLRP3炎癥小體介導的LDH釋放，能夠正調控NLRP3炎癥小體信號通路的活性。

圖1 TRAF6與NLRP3相互作用

3 討論

炎癥小體主要由受體蛋白、含CARD結構域的ASC和caspase-1前體（pro-caspase-1）構成[10]。不同的受體蛋白響應不同的刺激信號，從而介導炎癥小體的組裝，進而激活下游信號通路。

NLRP3炎癥小體可以被機體內多種PAMP和DAMP所活化。研究表明，細胞內鉀離子和鈣離子濃度的變化、線粒體損傷后釋放的線粒體DNA和活性氧（reactive oxy gen species，ROS）、顆粒物微晶尿酸鈉（monosodium urate，MSU）等都能夠激活NLRP3炎癥小體[11-15]，翻譯后修飾（post-transla?tional modification，PTM）在NLRP3炎癥小體信號通路的調控中也起重要作用。

圖2 TRAF6下調NLRP3的蛋白穩定性

圖3 TRAF6抑制NLRP3炎癥小體介導的LDH釋放

研究表明，有絲分裂相關的絲蘇氨酸激酶Nek7能夠調節NLRP3炎癥小體的活化，抑制Nek7的表達可以阻斷NLRP3炎癥小體的組裝和活化[16-17]。盡管鑒定Nek7在炎癥小體活化中的作用是該領域近年來的重要進展之一，但Nek7調控NLRP3炎癥小體活化的具體機制還須進一步探究。激酶JNK1也能促進NLRP3磷酸化，該磷酸化修飾介導了NLRP3去泛素化及寡聚化，進而促進NLRP3炎癥小體的激活[18-20]。NLRP3炎癥小體的活性除了受到激酶的調控，文獻報道磷酸酶2A（phosphatase 2A，PP2A）可通過使NLRP3 PYD（pyrin domain，PYD）結構域去磷酸化而調節炎癥小體的組裝，可見激酶和磷酸酶之間的平衡對于NLRP3的活化是重要的調節元件。除了磷酸化修飾參與的調控，泛素化修飾也在其中起著重要的作用，有文獻報道，NLRP3炎癥小體活化時依賴其自身的去泛素化，抑制去泛素化酶BRCC3的表達能夠顯著抑制NLRP3炎癥小體的活化[21]。

盡管近年來關于NLRP3炎癥小體活化機制的研究取得了一些重要的進展，但仍然還有很多問題很不清楚。比如，目前已知的NLRP3炎癥小體激活劑是如何最終激活NLRP3的，還有哪些成分能夠激活NLRP3炎癥小體，調控NLRP3炎癥小體信號轉導的成分有哪些、它們是如何起作用的等。本研究揭示了TRAF6通過增加NLRP3的穩定性正調控NLRP3炎癥小體信號通路的分子機制，這不僅闡明了重要信號分子TRAF6的新功能，而且為理解NLRP3炎癥小體激活的分子機制提供了重要的啟示。但是TRAF6調控NLRP3炎癥小體信號通路的具體分子機制是什么，TRAF6是否依賴于其自身E3泛素蛋白連接酶活性泛素化修飾NLRP3促進其穩定性增加，TRAF6是否特異性地調控NLRP3炎癥小體信號通路，TRAF6是否特異性地調控某些成分激活的NLRP3炎癥小體信號通路，這些都還有待進一步研究。