樺褐孔菌乙酸乙酯提取物抗食管癌作用的研究

李艷青，齊婷娟，郭婷婷，李霄，周玉柏

北京工業大學 生命科學與生物工程學院，北京100124

食管癌是世界第七大癌癥，在常見癌癥死亡原因中位列第六位，2018年新發病例約57萬，死亡病例約50萬[1]。食管癌的標準治療為手術切除并輔以放化療。然而，由于食管癌早期癥狀不明顯以及腫瘤的侵襲性和轉移活性較強，患者就診時大多已處于疾病的晚期，因此預后較差，綜合5年生存率不超過20%[2]。

樺褐孔菌［Inonotus obliquus（Fr.）Pilat］是擔子菌亞門、多孔菌科、纖孔菌屬真菌，又稱樺樹茸、白樺茸，是生長在白樺樹上的大型藥用真菌，菌核直徑7～36 cm，形似肉瘤狀平伏在樹皮下，呈黃褐色至黑色，有明顯凹凸不平開裂的小塊，主要分布于俄羅斯西伯利亞、遠東地區，日本北海道，以及我國黑龍江和吉林長白山地區[3]。樺褐孔菌的主要藥理作用包括抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、降低弓形蟲感染等，且細胞毒性低，無明顯副作用[4]。我們研究了樺褐孔菌乙酸乙酯提取物對食管癌細胞株EC-109和EC-9706的增殖、克隆形成能力、凋亡及細胞周期等方面的影響，初步揭示了樺褐孔菌對食管癌細胞株的作用機理，為樺褐孔菌抗食管癌的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

樺褐孔菌藥材購自吉林省白山市；食管癌細胞株EC-109和EC-9706購自ATCC；DMSO、AnnexinVFITC/PI凋亡檢測試劑盒、DNA含量檢測試劑盒購自Solarbio公司；DMEM培養基購自Gibco公司；中草藥粉碎機購自天津市泰斯特儀器有限公司；Rotavapor R-200旋轉蒸發儀購自Buchi公司；NovoCyte3130細胞流式儀購自艾森生物公司；全波長酶標儀購自Perkin Elmer公司；KD-300DE型數控超聲波清洗器購自昆山市儀器有限公司。

1.2 樺褐孔菌乙酸乙酯提取物制備

稱取樺褐孔菌粉末100 g，加入95%乙醇1000 mL，回流提取2次，合并濾液，用旋轉蒸發儀減壓回收溶劑，然后加去離子水至100 mL，用乙酸乙酯萃取3次，每次加入乙酸乙酯約100 mL，合并乙酸乙酯萃取液，減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯提取物5.52 g。

1.3 細胞培養

食管癌細胞株EC-109、EC-9706用含10%胎牛血清（FBS）和100μg/mL青霉素和鏈霉素的DMEM培養基，于5% CO2、37℃培養箱中培養。

1.4 MTT法細胞增殖實驗

將對數生長期的EC-109、EC-9706細胞按1×104/孔接種于96孔板，培養24 h后，將樺褐孔菌乙酸乙酯提取物以12.5、25、50、100、200μg/mL的濃度設置5個梯度，每組設5個復孔，每孔加入100μL不同濃度的乙酸乙酯提取物，同時設置空白和對照組；培養48 h后，各板加入20μL/孔MTT，37℃孵育4 h，棄舊培養基，加150μL DMSO，用酶標儀測定D490nm值。

1.5 平板克隆形成實驗

將EC-109、EC-9706細胞按200/孔接種于6孔板，加入相應劑量的乙酸乙酯提取物，每3 d更換含乙酸乙酯提取物的培養基，繼續培養12 d。PBS洗2次，0.1%結晶紫甲醇溶液固定染色25 min，進行細胞克隆計數。

1.6 細胞凋亡實驗

將1×104/孔EC-109、EC-9706細胞接種6孔板，24 h后加入相應劑量的乙酸乙酯提取物；繼續培養48 h后收集細胞，PBS洗2次，用1 mL 1×結合緩沖液重懸細胞，取100μL細胞懸液，加入5μL AnnexinV-FITC，室溫避光孵育10 min；加入5μL PI溶液，室溫避光孵育5 min；加入PBS至500μL，輕輕混勻，過300目尼龍篩網，在1 h內用流式細胞儀進行檢測。

1.7 細胞周期實驗

實驗分組及細胞處理與細胞凋亡實驗相同，加入乙酸乙酯提取物并繼續培養48 h后收集細胞，PBS洗1次，在細胞中加入500μL預冷的70%乙醇，4℃固定12 h，離心去上清，PBS洗2次；加入100μL RNaseA溶液，37℃水浴30 min；加入400μL PI染色液，4℃避光孵育30 min；過300目尼龍篩網，用流式細胞儀檢測。

1.8 統計學處理

采用GraphPad Prism 7軟件進行數據統計與做圖，數據用x±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組之間用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT細胞增殖實驗

與對照組相比，乙酸乙酯提取物可顯著抑制食管癌細胞EC-109和EC-9706的增殖，且隨著乙酸乙酯提取物濃度的增加，細胞抑制率也明顯增加（圖1，P＜0.05）。

2.2 平板克隆形成實驗

乙酸乙酯提取物在不同濃度下對EC-109和EC-9706細胞的克隆形成均表現出抑制作用，且抑制率呈濃度依賴關系，與對照組相比具有顯著性差異（圖2，***P＜0.001）。

2.3 細胞凋亡實驗

將食管癌細胞株EC-109和EC-9706分別用樺褐孔菌乙酸乙酯提取物處理后，進行流式細胞儀檢測，結果如圖3、4。與陰性對照組相比，乙酸乙酯提取物處理后的細胞凋亡率明顯增加，表明樺褐孔菌乙酸乙酯提取物促進了EC-109（P＜0.001）和EC-9706（P＜0.001）細胞株的凋亡。

圖1 乙酸乙酯提取物對食管癌細胞生長的抑制率（x±s，n=5）

2.4 細胞周期實驗結果

用樺褐孔菌乙酸乙酯提取物處理食管癌細胞株EC-109和EC-9706后，用流式細胞儀檢測細胞周期。如圖5所示，在EC-109細胞中，相較于對照組，乙酸乙酯提取物組細胞被阻滯在G1期的細胞顯著增加（P＜0.001）；如圖6所示，在EC-9706細胞中，相較于對照組，停留在G1期的細胞顯著增加（P＜0.001）。實驗結果表明樺褐孔菌的乙酸乙酯提取物影響了食管癌細胞株EC-109、EC-9706的周期進程，從而對細胞增殖產生影響。

3 討論

圖2 樺褐孔菌乙酸乙酯提取物對食管癌細胞克隆形成能力的影響

圖3 流式細胞術檢測乙酸乙酯提取物對食管癌細胞EC-109凋亡的影響

圖4 流式細胞術檢測乙酸乙酯提取物對食管癌細胞EC-9706凋亡的影響

圖5 樺褐孔菌提取物對食管癌細胞EC-109細胞周期的影響

圖6 樺褐孔菌提取物對食管癌細胞EC-9706細胞周期的影響

樺褐孔菌對多種腫瘤細胞有明顯的抑制作用[5-9]，但其具體抗腫瘤作用機制卻不甚清楚。現代研究表明，樺褐孔菌含有215種化學成分，其中已報道的具有生物活性的主要有多糖、羊毛甾醇型三萜類、樺褐孔菌醇、樺褐孔菌素、黑色素類和木質素類等成分[10-15]。在眾多化學成分中，樺褐孔菌多糖是樺褐孔菌的主要化學成分，同時也是其主要的活性成分。樺褐孔菌多糖構成比較復雜，常見的主要成分有雜多糖、β葡聚糖以及它們的蛋白質復合物等[16-17]，目前對其化學成分和藥理作用的研究較多。然而，樺褐孔菌乙酸乙酯提取物的抗腫瘤活性及機理研究并不充分。

本研究選擇食管癌細胞為研究對象，重點探討樺褐孔菌乙酸乙酯提取物對腫瘤細胞的作用及其內在機理。首先，在細胞水平上采用經典的MTT法檢測樺褐孔菌乙酸乙酯提取物對食管癌細胞EC-109和EC-9706增殖的影響，結果顯示乙酸乙酯提取物可顯著抑制食管癌腫瘤細胞的增殖，平板克隆實驗也進一步確證乙酸乙酯提取物可抑制食管癌細胞的增殖。流式細胞術結果顯示，經乙酸乙酯提取物處理的腫瘤細胞的細胞周期被阻滯在G1期，且細胞調亡的比率顯著高于對照組。上述結果提示，乙酸乙酯提取物通過影響腫瘤細胞周期及凋亡通路來抑制食管癌細胞的增殖，發揮其抗腫瘤的活性，但其確切的作用靶點還有待后續研究進一步確定。

綜上，本研究結果表明樺褐孔菌乙酸乙酯提取物能有效抑制食管癌細胞EC-109和EC-9706的增殖，并且能夠減弱細胞克隆形成能力，且樺褐孔菌乙酸乙酯提取物潛在的作用靶點可能位于細胞周期和細胞凋亡通路中。樺褐孔菌乙酸乙酯提取物具有一定的抗食管癌活性。