無機硒肥對土壤有效氮含量及菠菜品質的影響

史雅靜，史雅娟，王玉榮，王慧敏，秦禮凱

（1 遼寧科技學院生物醫藥與化學工程學院/遼寧省生物醫藥與化學工程重點實驗室，遼寧本溪 117004；2 中國科學院生態環境研究中心/城市與區域國家重點實驗室，北京 100085）

硒被公認為人類和動物必需的微量營養素，具有防癌抗癌、清除體內自由基、抗衰老等多種功能[1-2]，據估計全球約有10億人口硒攝取量不足[3]。因此，適量補硒是增強人體健康、防治疾病和延年益壽的有效措施，而食用富硒植物吸收硒元素仍然是人體補硒的有效途徑[4-6]。生產上常用亞硒酸鈉 (Na2SeO3)作為富硒植物的無機硒肥，施加的劑量因施肥方式不同而異。有研究顯示，采用噴施、浸泡作物等方式施肥的Na2SeO3濃度一般在2～15 mg/kg范圍[7-8]，土壤中施Na2SeO3濃度一般在0.25～5 mg/kg范圍[9-10]。多年來，在富硒生產中人們更多關注的是植物從根部、葉面將外源硒吸收轉化為可食部分的轉化率，這決定了作物的富硒效果[7,11-13]，并成為富硒生產的關鍵，而在硒肥對富硒作物其他營養品質的影響方面關注卻較少。

目前，國內外學者已開展了Na2SeO3對土壤中微生物代謝能力，植物吸收、轉運硒、促進作物生長能力等方面的研究[7,14-17]，認為施加適量Na2SeO3對土壤酶活性、微生物的數量會產生一定影響，可以促進植物生長發育，進而提高作物產量[4,18-20]。但Na2SeO3對土壤氮素代謝影響研究還不夠完善，并且缺少Na2SeO3在土壤中被根部吸收并轉化為作物品質的路徑的綜合分析。因此，本研究選取常見蔬菜—菠菜作為栽培植物，選用3個與富硒生產接近的Na2SeO3濃度，研究不同濃度Na2SeO3對土壤有效氮含量、脲酶活性，以及菠菜硝酸鹽、維生素C、可溶性蛋白、可溶性糖含量等指標的影響，綜合分析Na2SeO3在土壤中被根部吸收、轉化的可能路徑，為生物強化生產富硒農產品及調控硒的安全水平提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菠菜 (Spinacia oleraceaL.)為小尖葉本地土菠菜，青縣艾森蔬菜良種推廣中心生產。

供試土壤采自山東省淄博市清潔自然土壤，以多點取樣法采集表層0—30 cm深的土壤，自然風干，研磨后過2 mm篩。土壤基本理化性質為pH值7.34，粘粒28.9%，有機質含量5.73 g/kg，全氮含量0.650 g/kg，總硒含量0.790 mg/kg。

供試有機肥 (總氮0.86%，有機碳73.12%) 主要為通過赤子愛勝蚓 (Eisenia foetida) 處理有機固體廢棄物 (秸稈∶菇渣∶牛糞=3∶2∶1) 后制成的蚓糞有機肥。

供試亞硒酸鈉 (Na2SeO3) (分析純，純度 ＞ 98%)為沈陽化學試劑廠生產。

1.2 試驗設計

采用盆栽試驗，設4個處理為每千克土施用亞硒酸鈉0 (CK)、1、10、30 mg，每個處理10個重復。具體試驗方法為：選擇內徑18 cm、深度15 cm的塑料盆，將不同濃度的Na2SeO3用去離子水配成溶液后加入土中充分拌勻，每盆裝土1.5 kg，均施入有機肥50 g作為底肥，每盆播種40粒種子，5天出苗，7天后間苗至10株，14天后每盆定植5株，并置于人工氣候箱中培養 (相對濕度60%，溫度20℃，光照/黑暗各12 h)，分別于定植后的第14、28、42天每個處理隨機取4盆，測定其菠菜葉中可溶性糖、可溶性蛋白、Vc、硝酸鹽含量及土壤銨態氮、硝態氮的含量、脲酶活性等指標。

1.3 測定方法

土壤pH采用水土1∶10浸提，pH計測定；粘粒含量用激光粒度儀測定；土壤有機質用重鉻酸鉀容量法；全氮用凱氏定氮法；NH4+-N含量采用靛酚藍比色法；NO3--N含量采用紫外分光光度法 (雙波長法)；脲酶活性采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法；Vc (鮮樣) 含量采用2，6-二氯酚靛酚比色法；還原糖 (鮮樣) 含量采用3，5-二硝基水楊酸比色法；可溶性蛋白 (鮮樣) 含量采用考馬斯亮藍G-250染色法；硝酸鹽 (鮮樣) 含量采用紫外吸收法。

1.4 數據分析

數據采用Excel 2016軟件對數據進行處理和作圖；運用SPSS19.0統計軟件中單因素方差分析(ANOVA) 和最小顯著差異 (LSD) 分析不同處理間的差異顯著性 (α = 0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同濃度的Na2SeO3處理對土壤脲酶活性的影響

如圖1所示，培養初期 (14天)，低劑量 (≤ 10 mg/kg) 的Na2SeO3處理，可使土壤脲酶活性較對照明顯增加 (P＜ 0.05)，30 mg/kg Na2SeO3處理組的土壤脲酶活性沒有明顯變化，處于對照水平。培養到中期 (28天) 時，除了10 mg/kg Na2SeO3處理組的土壤脲酶活性較對照有明顯增加以外，其余各處理均沒有明顯變化。培養進入到后期，Na2SeO3各處理組的土壤酶活性較對照均沒有明顯變化 (P＞ 0.05)。可見低濃度Na2SeO3對土壤脲酶活性有一定影響，較高濃度對其沒有影響。

2.2 不同濃度的Na2SeO3處理對土壤有效氮含量的影響

2.2.1 不同濃度的Na2SeO3處理對土壤NO3--N含量的影響 圖2表明，1 mg/kg和30 mg/kg Na2SeO3處理組在整個培養期內均使土壤NO3--N含量明顯增加，到后期 (42天) 均有下降趨勢，但仍然高于CK處理組，具有顯著性差異 (P＜ 0.05)，其中在28天時1 mg/kg Na2SeO3處理組較CK提高了75%，達到最大值；而10 mg/kg Na2SeO3處理組對土壤的NO3--N含量影響，在培養初期 (14天) 略有增加 (P＜ 0.05)，到中后期 (28天、42天) 硝態氮含量下降至對照水平，差異不顯著 (P＞ 0.05)。可見不同濃度的Na2SeO3對土壤NO3--N含量影響不同。

圖1 不同濃度亞硒酸鈉處理土壤脲酶活性Fig. 1 Urease activity in soil treated different concentrations of Na2SeO3

圖2 不同濃度Na2SeO3處理土壤硝態氮含量Fig. 2 -N content in soil treated with different concentrations of Na2SeO3

2.2.2 Na2SeO3對土壤NH4+-N含量的影響 如圖3所示，1 mg/kg和30 mg/kg Na2SeO3處理組在整個培養過程中對土壤NH4+-N含量影響表現為降低或接近對照水平，而10 mg/kg Na2SeO3處理組的土壤NH4+-N含量，隨著暴露時間的增加表現為逐漸下降趨勢，但均明顯高于CK處理組 (P＜ 0.05)?？梢?，適量濃度的Na2SeO3可以使土壤-N含量增加。

2.2.3 Na2SeO3對土壤-N/N-N比的影響 不同Na2SeO3處理不僅影響土壤的-N和-N含量，而且會影響到-N/-N比值，同時也將影響到作物硝酸鹽含量的變化。

圖3 不同濃度Na2SeO3處理土壤銨態氮含量Fig. 3 -N content in soil treated with different concentrations of Na2SeO3

由表1可知，1 mg/kg和30 mg/kg Na2SeO3處理組在整個培養期內-N/-N比值呈下降趨勢，且均高于CK處理，而且在14天時，-N/-N比值均 ＞ 1，說明在培養初期土壤-N占優勢，后期-N的含量逐漸增加，使-N/-N比值逐漸減少；10 mg/kg處理組在整個培養期內-N/-N比值均在對照水平上下波動，說明土壤-N與-N之間轉化速度接近對照水平。

2.3 不同濃度的Na2SeO3處理對菠菜品質的影響

2.3.1 不同濃度的Na2SeO3處理對菠菜硝酸鹽含量的影響 如圖4所示，1 mg/kg Na2SeO3處理組在整個培養過程中，可使菠菜中的硝酸鹽含量較CK明顯增加，差異顯著 (P＜ 0.05)。10 mg/kg Na2SeO3處理組菠菜硝酸鹽含量，培養初期 (14天) 略有增加(P＜ 0.05)，中后期 (28 天、42 天) 均在對照水平 (P＞0.05)。30 mg/kg Na2SeO3處理組在整個培養過程中，菠菜葉中硝酸鹽含量表現為初期 (14天) 和中期(28天) 明顯高于對照 (P＜ 0.05)，但是到后期 (42天)下降接近對照水平 (P＞ 0.05)。

表1 不同濃度Na2SeO3對土壤-N/-N比值的影響Table 1 Effect of different concentrations of Na2SeO3 on -N/-N ratios in soil

表1 不同濃度Na2SeO3對土壤-N/-N比值的影響Table 1 Effect of different concentrations of Na2SeO3 on -N/-N ratios in soil

Na2SeO3(mg/kg)NO3--N/NH4+-N 0 54.86 183.02 0.30 6.68 130.11 0.05 5.38 166.78 0.03 1 184.68 122.80 1.50 29.57 100.38 0.29 17.57 130.38 0.13 10 101.51 250.73 0.40 5.10 221.10 0.02 6.43 204.64 0.03 30 221.46 158.76 1.39 20.12 101.41 0.20 13.12 108.08 0.12 14 d 28 d 42 d NO3--N(mg/kg)NH4+-N(mg/kg)NO3--N/NH4+-N NO3--N(mg/kg)NH4+-N(mg/kg)NO3--N/NH4+-N NO3--N(mg/kg)NH4+-N(mg/kg)

圖4 不同濃度Na2SeO3處理菠菜硝酸鹽含量Fig. 4 Nitrate content in spinach leaves in soils treated with different concentrations of Na2SeO3

2.3.2 不同濃度的Na2SeO3處理對菠菜可溶性蛋白含量的影響 從圖5可以看出，Na2SeO3對菠菜可溶性蛋白含量的影響，隨著培養時間的延長整體上表現為上升趨勢，但不同濃度的Na2SeO3處理對菠菜可溶性蛋白含量影響略有不同。其中1 mg/kg Na2SeO3處理組在整個培養過程中，對菠菜可溶性蛋白含量影響表現為先降低后恢復到對照水平的趨勢；10 mg/kg Na2SeO3處理組對可溶性蛋白含量影響較對照均有明顯的增加，差異顯著 (P＜ 0.05)；30 mg/kg Na2SeO3處理組可溶性蛋白含量則表現降低—恢復—降低的趨勢。

圖5 不同濃度Na2SeO3處理菠菜可溶性蛋白含量Fig. 5 Soluble protein content in spinach leaves in soil treated with different concentrations of Na2SeO3

2.3.3 不同濃度的Na2SeO3處理對菠菜VC含量的影響 從圖6可以看出，不同濃度的Na2SeO3處理對菠菜VC含量的影響不同。1 mg/kg Na2SeO3處理組菠菜Vc含量在培養初期明顯增加 (P＜ 0.05)，中后期均在對照水平 (P＞ 0.05)；10 mg/kg Na2SeO3處理組使菠菜Vc含量增加明顯 (P＜ 0.05)；30 mg/kg Na2SeO3處理組菠菜Vc含量較對照均沒有變化 (P＞0.05)。

圖6 不同濃度Na2SeO3處理菠菜Vc含量Fig. 6 Vc content in spinach leaves in soil treated with different concentrations of Na2SeO3

圖7 不同濃度Na2SeO3處理菠菜可溶性糖含量Fig. 7 Soluble sugar content in spinach leaves in soil treated with different concentrations of Na2SeO3

2.3.4 不同濃度的Na2SeO3處理對菠菜可溶性糖含量的影響 從圖7可知，與對照相比，除了10 mg/kg Na2SeO3處理組在28天內菠菜可溶性糖明顯增加和30 mg/kg處理組在培養后期 (42天) 菠菜可溶性糖明顯減少以外 (P＜ 0.05)，其余各處理對菠菜可溶性糖含量影響不大 (P＞ 0.05)。

2.3.5 Na2SeO3對土壤有效氮含量及菠菜品質影響路徑分析 Na2SeO3是水溶性的，是植物的重要硒源。Na2SeO3進入土壤在根部—作物之間被吸收、轉運、轉化的路徑如圖8所示。

當Na2SeO3被施入土壤內，一種路徑是其通過影響土壤酶系統，進而影響土壤的氮素代謝，最終反映在土壤NH4+-N和NO3--N含量的變化上[21]；NH4+-N和NO3--N是植物吸收的主要N素形態，進入根細胞內NH4+-N直接參與含N化合物的合成，而NO3--N一部分貯存在液泡，或者進入質體在硝酸還原酶(NR) 作用下，形成NH4+-N，參與含N化合物的合成。根細胞中NO3--N在導管中隨蒸騰流到達葉肉細胞內，分布于細胞的液泡和原生質體中，由于NR主要存在于原生質中，其中的NR可以迅速還原，不易積累；而液泡中的NR活性低，硝酸鹽主要起滲透調節作用，難以被還原利用，因而易被累積[22]，進而影響到蔬菜的安全品質。同時NO3--N在原生質和葉綠體內均可以轉化為NH4+-N，為蛋白質、葉綠素等含氮化合物的合成提供原料，并且間接影響到光合作用的產物可溶性糖和Vc含量變化。

另一條路徑是Na2SeO3進入土壤直接被根部吸收，進入作物體內發生形態上轉化，直接或間接參與蛋白質的合成。有研究表明，Na2SeO3通過磷酸鹽轉運子進入根部，進入根部后可轉化為硒酸鹽和其他硒化物向地上部分運輸到葉片，再由無機硒轉化為有機硒，一方面有機硒非特異性參與蛋白質合成，影響作物蛋白含量變化。另一方面在某些硒超積累植物中可以轉化為揮發性硒化物，從而降低硒與蛋白的結合，達到降低硒毒害的作用用[11]。

圖8 亞硒酸鈉對土壤有效氮含量及作物品質影響路徑Fig. 8 Pathway of the effect of Na2SeO3 on soil available nitrogen content and crop quality

綜合分析Na2SeO3在土壤中被根部吸收并轉化為作物品質的路徑可以看出，不同濃度Na2SeO3不僅對土壤脲酶、有效態氮含量及其NO3--N/NH4+-N比有一定的影響，而且也影響作物從根部、葉面將外源硒吸收轉化為可食部分的轉化率[9,12,14]，同時作物品質也隨著發生不同程度的變化。有試驗表明，低濃度(1.095 mg/kg) 亞硒酸鈉處理的作物中硒含量明顯高于對照組[9]，而本試驗顯示，相似劑量亞硒酸鈉處理條件下，作物各項營養指標品質含量有不同程度變化，如1 mg/kg Na2SeO3處理組可使菠菜葉的硝酸鹽含量明顯增加，Vc含量先增后減，可溶性蛋白含量減少，可溶性糖含量沒有變化。可見硒在植物體內轉化率與硒對作物品質影響之間沒有明顯的相關性。

3 討論

土壤中一切生化過程都是在酶的參與下進行的，土壤酶活性直接影響著土壤有效養分的釋放，其中脲酶是土壤氮素循環中的關鍵酶之一，也是專一水解尿素的酰胺酶，其活性高低在一定程度上反映了土壤氮素水平狀況和植物有效氮源的利用[23]。土壤中氮素的形態可分為有機態氮和無機態氮兩大類。土壤中的氮絕大部分以有機態形式存在，大多數是不能直接被作物吸收利用的含氮化合物，它們需經微生物分解轉變為無機態氮后才能為作物利用[24]。無機態氮主要以NH4+-N和NO3--N形式存在，它們是植物從土壤中直接吸收利用的主要氮形態[25]，其含量受諸多因素的影響，如土壤溫度、水分、理化性質、有機、無機肥的施用等[26]。本研究發現，低劑量(≤ 10 mg/kg) 的Na2SeO3處理下土壤脲酶活性表現為先被激活后減弱至對照水平的變化趨勢。土壤硝態氮含量也表現出相同的變化趨勢，而銨態氮與硝態氮含量變化趨勢正好相反?？赡苁怯捎诘蛣┝康膩單徕c在土壤微生物的作用下能被微生物分解、利用，有利于微生物的生長，促進土壤中細菌、真菌和放線菌等微生物數量增加，而微生物數量的增加有助于土壤酶的合成與分泌，導致脲酶活性增加[15]，使脲酶水解產物NH4+-N不斷轉化為NO3--N，NO3--N含量不斷增加，銨態氮NH4+-N含量變化不明顯。但隨著培養時間的延長，大部分的Na2SeO3被微生物分解完成，微生物可利用的有效態減少，致使微生物的數量減少，同時未被同化的的Na2SeO3一是可能被植物根部直接吸收，二是可能被土壤吸附，與有機物和碳酸鹽、鐵錳氧化物結合，從而降低其有效性，因此導致后期脲酶活性減弱[27]。而較高劑量 (30 mg/kg) Na2SeO3處理對細菌和真菌數量有降低作用，減少了菌體的合成和分泌[15]，導致土壤脲酶活性減弱。蔬菜生長過程中又不斷產生根系分泌物進入土壤中，使根際微生物的數量發生變化[28]，致使土壤脲酶活性減弱不明顯，產生的NH4+-N在后期由于轉化成大量NO3--N供植物吸收利用，使土壤NH4+-N含量較少。

不同濃度Na2SeO3不僅對土壤酶活性、有效態氮含量及其NO3--N/NH4+-N比有一定的影響，而且也影響菠菜的品質。

硝酸鹽含量高低是衡量蔬菜安全品質好壞的一個重要指標，而菠菜屬于硝酸鹽高累積蔬菜之一[29-30]。硝酸鹽在植物體內的積累是一個氮素在植物體內吸收轉化與積累的過程，基質中銨態氮和硝態氮的比例是決定硝酸鹽含量的重要因素[31]。本研究顯示，1、30 mg/kg Na2SeO3處理組可使菠菜中的硝酸鹽含量較對照有不同程度增加?？赡苁怯捎谄銷O3--N/NH4+-N比值均高于對照，而且土壤中硝態氮占的比例高，如果植物吸收的硝態氮的速率大于同化的速率，硝態氮會在植物體內積累，硝酸鹽含量也相應增加[32]。而10 mg/kg Na2SeO3處理組菠菜硝酸鹽含量增加很少，或接近對照水平，可能是由于初期 (14 d)的NO3--N/NH4+-N比值略高于對照，而中后期的NO3--N/NH4+-N比值接近或略低于對照，當銨態氮占優勢時，植物硝酸鹽含量下降。因為銨態氮被植物吸收后，立即參與合成作用，而硝態氮被植物吸收后要先還原成銨態氮后才能參與合成過程，此還原過程需耗能且需有相應的酶系統參與[31]。

可溶性蛋白是構成果蔬中酶的重要組成部分，參與多種生理生化代謝過程的調控，與果蔬的生長發育、成熟衰老和抗性密切相關[33-34]。有研究表明，噴施亞硒酸鈉可使苦苣中可溶性蛋白含量表現為降低-升高-降低的變化趨勢[35]。本研究在1、30 mg/kg Na2SeO3處理組的可溶性蛋白含量也表現出相似的變化趨勢。可能的原因是Na2SeO3供給植物后，在根部被吸收并轉化為硒酸鹽和其它硒化物向地上部運輸至葉片，并由無機硒轉化為有機硒，非特異性的參與蛋白質的合成，這一轉化速度小于根吸收過程，因此在根內常積累一定量的硒[36]，表現為土壤脲酶活性受到不同程度的影響，土壤有效氮也隨之變化，而有效氮被植物吸收進入葉肉細胞以后，NO3--N在原生質和葉綠體內均可以轉化為NH4+-N，為蛋白質的合成提供原料。并且通過本試驗發現在10 mg/kg處理組對NH4+-N含量的影響大于NO3--N，土壤中NH4+-N占優勢，而NH4+-N被植物吸收后，立即參與合成作用，致使可溶性蛋白含量增加[31]。

Vc又稱抗壞血酸，是一種普遍存在于植物組織的抗氧化物質[37]，主要利用光和產物葡萄糖-6-磷酸為原料通過L-半乳糖途徑在線粒體中合成的[38-39]。Na2SeO3通過影響土壤的有效氮含量變化，間接影響到光合作用產物Vc含量的變化。有研究表明，適量硒肥可以提高番茄、菠菜等作物的Vc含量[32,40]。本研究中10 mg/kg Na2SeO3處理組使菠菜Vc含量增加明顯，這也證實了這一結論。可能原因是由于硒能夠提高植株中硒蛋白的含量，從而減輕植株細胞內過氧化氫和脂質過氧化物對Vc的氧化作用[19,41]。另外，10 mg/kg Na2SeO3處理組的NH4+-N含量增加明顯，可以為蛋白質和葉綠素等含氮化合物的合成提供更多原料，從而間接影響與光合產物相關的Vc含量的變化。

可溶性糖是植物的光合產物[42]，也是碳水化合物代謝和短暫貯藏的主要形式，對高等植物生長發育及生殖有重要影響[43]。有研究表明，用適量的Na2SeO3處理可使蘋果、苦苣等果蔬的可溶性糖含量增加[35,44]。本試驗中10 mg/kg Na2SeO3處理組28 d內菠菜可溶性糖含量變化也顯示同樣的結果。可能原因是由于Na2SeO3處理使土壤中的銨態氮含量占優勢，植物吸收后為葉綠素提供原料，間接使光合作用產物可溶性糖含量增加。而30 mg/kg處理組在培養后期 (42天) 可溶性糖含量出現下降，可能是在培養后期 (42天) 的土壤中NH4+-N含量減少，植物吸收后為葉綠素提供原料減少，使光合作用產物可溶性糖的含量相應減少，這與王建飛等[32]、張春蘭等[45]研究的結果是一致的。

4 結論

1) 低劑量 (≤ 10 mg/kg) 的 Na2SeO3處理下土壤脲酶活性表現為先被激活后減弱至對照水平的趨勢。土壤硝態氮含量也表現出相同的變化趨勢，而銨態氮含量變化趨勢正好相反；較高劑量 (30 mg/kg)Na2SeO3處理對土壤脲酶活性沒有明顯的影響，在整個培養時期均在對照水平。土壤NH4+-N含量表現為后期明顯減少，轉化成的NO3--N明顯增加，有利于吸收利用。

2) 不同濃度的Na2SeO3不僅對土壤脲酶、NH4+-N和NO3--N含量及NO3--N/NH4+-N比值產生不同影響，而且也影響到菠菜品質。本研究結果顯示，1 mg/kg Na2SeO3處理組可使菠菜葉的硝酸鹽含量明顯增加，Vc含量先增后減，可溶性蛋白含量減少，可溶性糖含量沒有變化；10 mg/kg處理組可使菠菜葉中的硝酸鹽、可溶性糖含量表現為先增后減，Vc含量、可溶性蛋白含量均有不同程度增加；30 mg/kg處理組可使菠菜葉的硝酸鹽含量先增后減，可溶性蛋白、可溶性糖含量減少，Vc含量沒有變化。

3) 硒在植物體內轉化率與硒對作物品質影響之間沒有明顯的相關性。富硒作物生產中無機硒肥施用量要綜合考慮硒在作物體內的轉化率及硒對作物品質影響的各項因素而確定。

致謝：本試驗過程中得到本鋼板材股份有限公司徐明的幫助，特此感謝！