冬凌草甲素可逆共價分子印跡聚合物的制備及其性能研究

黃少梅 張亞楠 楊萬里 何建峰

（1佛山市第三人民醫院 廣東 佛山 528041）

（2廣州康盛生物科技有限公司 廣東 廣州 510663）

（3廣州中醫藥大學 廣東 廣州 510006）

冬凌草甲素是冬凌草中抗癌效果最強的成分，且副作用小，它在癌癥方面的治療作用[1]已經引起人們的高度重視。分子印跡技術是一種制備對模板分子具有高度識別能力聚合物的技術。制備過程簡單，制備的聚合物性質穩定，因此在藥物分離，固相萃取，生物傳感器等領域具有廣泛的應用[2]。本研究用冬凌草甲素作為模板分子，4-乙烯基苯硼酸為功能單體，采用可逆共價結合方式制備對冬凌草甲素具有高度識別能力的分子印跡聚合物。

1.試劑及儀器

冬凌草甲素（Oridonin，規格98%，澤朗植提）；4-乙烯基苯硼酸（規格80%，天津阿法埃莎化學有限公司）；二乙烯基苯（DVB，AR，上海阿拉丁試劑有限公司，使用前減壓蒸餾）；其他試劑均為AR。

2.實驗部分

2.1 冬凌草甲素共價印跡聚合物的的制備

稱取0.0365g（0.1mmol）冬凌草甲素模板分子，0.0140g（0.1mmol）功能單體4-乙烯基苯硼酸，溶于30mL 1，4-二氧六烷（H2SO4作為催化劑）于88℃下攪拌回流1h，5000rpm-1離心30分鐘，用少量甲醇洗后干燥得預聚體。將預聚體溶液轉入到試管中，依次加入0.746g(5.73mmol)DVB或0.547g(2.76mmol)乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，0.01g 0.06mmol)偶氮二異丁腈（AIBN）及2.0mL的1，4-二氧六烷，然后通氮10min，密封后置于65℃水浴中恒溫反應36h。反應得到白色塊狀聚合物，將聚合物研磨并過120目篩，得聚合物微粒。用甲醇-鹽酸(pH=3)(v/v，7∶3)洗脫，直至抽提液經紫外檢測無模板分子吸收為止。得到的分子印跡聚合物（MIP）在65℃下真空干燥24h，備用。

空白聚合物NIP的制備方法同上，但不加模板分子。

2.2 分子印跡聚合物的性能研究

2.2.1 動力學吸附研究 準確稱取六份10mg MIP置于10mL磨口錐形瓶中，分別加入2mL 2mmol·L-1冬凌草甲素的甲醇-磷酸緩沖液（pH=7.40）(v/v，7∶3)標準溶液，置于磁力攪拌器中攪拌，分別于5min、15min、30min、1h、3h、5h收集樣品，用0.22μm微孔濾膜過濾，經紫外光度法檢測濾液中待測物的濃度，計算出聚合物在各時間點對模板分子的吸附量Q（μmol·g-1）。

2.2.2 聚合物的底物選擇性研究 準確稱取五份10mg MIP和NIP分別置于10mL磨口錐形瓶中，分別加入2mL 2mmol·L-1冬凌草甲素、5-氟尿嘧啶、氯霉素、苯基-1，2-乙二醇、茶堿的甲醇-磷酸緩沖液（pH=7.40）(v/v，7∶3)標準溶液，室溫下攪拌24h，用0.22μm微孔濾膜過濾，經紫檢測濾液中待測物的濃度，計算出聚合物對模板分子的吸附量Q（μmol·g-1）。

3.結果與討論

3.1 MIP洗脫條件探討

聚合物中冬凌草甲素和功能單體是以可逆共價鍵的方式結合的，性質較穩定。經過查閱相關文獻發現，甲醇-水溶液和pH=3.0的鹽酸對酯鍵的水解具有促進作用，因此對洗脫條件進行以下探討：首先，采用甲醇-鹽酸（pH=3.0）(v/v，1∶1)在常溫下攪拌洗脫24h，通過紫外分光光度計檢測發現洗脫率較低。隨后將聚合物于60℃攪拌回流，洗脫率明顯增加，結合冬凌草甲素在水中的溶解度較低，研究最后采用甲醇-鹽酸緩沖液（pH=3.00）(v/v，7∶3)為洗脫劑，于60℃攪拌回流，其洗脫率最高。

3.2 MIP結構表征

MIP（洗脫前）IR數據（3438.56，1723.30，1141.64，1071.06，989.04cm-1）；MIP（洗脫后）IR數據（3441.30，1138.18，1068.77，992.33cm-1）。對照兩者紅外光譜數據發現，未洗脫的MIP存在一個羰基峰（1723.30cm-1），即模板分子冬凌草甲素的羰基峰，洗脫干凈的MIP的紅外光譜圖上未出現冬凌草甲素羰基峰。結果顯示，MIP中的模板分子被完全洗脫液徹底去除。此外，空白聚合物的紅外光譜圖，NIP：IR（3437，1152.06，1075.25，989.10cm-1），由于空白聚合物與洗脫后MIP結構組分相同，而兩者的紅外光譜圖其主要特征峰基本保持一致。

3.3 MIP吸附性能評價

3.3.1 動力學吸附 動力學實驗結果表明，MIP的吸附在5 h后已逐漸趨向平衡，共吸附74.1μmol·g-1，其中，5min可達到平衡吸附量的15.3%（11.31μmol·g-1），15 min可達到平衡吸附量的39.6%（29.34μmol·g-1）。

3.3.2 選擇性吸附 聚合物對底物的結合分配系數科描述為Kd=CP/CS，式中CP（μmol/g）為底物在聚合物上的結合量；CS(mmol·L-1)為平衡吸液中底物的濃度。分離因子α描述為α=Kdi/Kdj，式中Kdi/Kdj分別為模板與結構類似物的結合分配系數。Kd值越高，表示聚合物對該底物的結合量越大；ɑ值越高，表示聚合物對底物的選擇性越好。

硼酸基團對1，2-順式二醇比其他醇類選擇性更強。根據這一理論特點，我們分別選取具有1，3-二醇化合物氯霉素、5-氟尿嘧啶，1，2-鄰二醇基團的化合物苯基-1，2-乙二醇和冬凌草甲素作為聚合物的底物，對其選擇性進行探討。見表。

表1 聚合物對不同底物的選擇性

聚合物：10mg；底物濃度：2mmol·L-1；底物用量=2mL；吸附溶劑：甲醇-磷酸緩沖液（pH=7.40）(V/V，7∶3)；吸附時間：24小時；吸附溫度25℃。

從表可看出，MIP對冬凌草甲素的吸附能力優于其他三種底物，表現出較好的選擇性。其中5-氟尿嘧啶空間結構較小，較易進入MIP孔穴結構中，Kd值較大。MIP與冬凌草甲素官能團互補的功能基團，再加上與其立體結構相互補的特定形狀的孔穴，使得MIP對冬凌草甲素顯示出特效的選擇結合特性。NIP數據中顯示，NIP對1-苯基-1，2-乙二醇也有較強的結合能力，這是由于冬凌草甲素與1-苯基-1，2-乙二醇都具有鄰二醇結構，在NIP表面與4-乙烯基苯硼酸的結合能力基本相同，但不具有孔穴結構的記憶選擇性。據此，我們可以推測是模板分子冬凌草甲素的順式鄰二醇基團與功能單體4-乙烯基苯硼酸的硼酸基團相互作用，并最終在聚合物的孔穴中產生了識別位點。

4.結論

本研究第一次以4-乙烯基苯基硼酸作為功能性單體，二乙烯基苯作為交聯劑制備出冬凌草甲素的共價分子印跡聚合物。在吸附實驗中采用可逆共價特異性結合的冬凌草甲素分子印跡聚合物不僅顯示出較快的吸附動力學速率和專一識別性能，且較利用分子間氫鍵結合的印跡聚合物[3]有更高的吸附量。這項研究也為具有順式二醇結構的中藥活性成分分離純化提供了重要參考。