大鼠在急性肺損傷中炎癥因子的表達(dá)及病理損傷

熱依拉·牙合甫 吐爾遜娜·買買提 李瑞晟 努爾阿米娜·鐵力瓦爾迪

阿帕爾·卡哈爾1 王琴1 范桂君1（通訊作者)

（1新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院老干科 新疆 烏魯木齊 830000）

（2新疆醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院/新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科 新疆 烏魯木齊 830011）

（3新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸科 新疆 烏魯木齊 830000）

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)是臨床常見的危重急癥，是由多種肺內(nèi)外致病危險因子導(dǎo)致的以血管通透性增加、透明膜形成為主要表現(xiàn)的炎癥綜合征，死亡率可高達(dá)50%～70%。

1.資料與方法

1.1 模型資料

選擇清潔型大鼠3月齡20只（新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供）體重約（220±50g），隨機分為：空白對照組（10只，簡稱K組，尾靜脈注射生理鹽水）；模型組（10只，簡稱L組，尾靜脈注射脂多糖6mg/kg）：

1.2 建模方法

（1）L組使用脂多糖(6mg/kg)稀釋成0.5ml進(jìn)行大鼠尾靜脈注射，K組使用0.5ml生理鹽水大鼠尾靜脈注射。（2）各組分為2小時、4小時、8小時3個時間點注射脂多糖（L組）和生理鹽水（K組），注射后2小時每組處死3只、4小時每組處死3只、8小時每組處死4只。

1.3 標(biāo)本獲取方法

使用大鼠左肺進(jìn)行灌洗取灌洗液，使用大鼠右肺下葉進(jìn)行病理學(xué)觀察，使用大鼠右肺上葉及中葉進(jìn)行NF-KB測定。處死動物后全暴露法打開動物胸腔，摘除右肺后結(jié)扎右肺支氣管，自喉部對氣管執(zhí)行氣管插管，用生理鹽水以大鼠體重的10%劑量的生理鹽水分3次進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，回收率不少于70%。回收灌洗液置于15ml離心管中以2000轉(zhuǎn)離心10min，取上清液，儲存于-80℃冰箱備用。取大鼠右肺下葉，沿支氣管使用6號套管針注人10%中性福爾馬林液，無菌箱中靜置待肺葉僵固，使用10%中性福爾馬林液浸泡固定，3d后切片，HE染色。大鼠右肺上葉、中葉置入EP管放入液氮中擬查NF-kB用。

1.4 觀察方法

1.4.1 病理學(xué)觀察 選擇大鼠右肺下葉組織，使用HE染色，每個標(biāo)本形成10個玻片，2名病理科醫(yī)師雙盲狀態(tài)下使用200倍光鏡觀察，采用Arold評分方法對肺水腫、肺泡及間質(zhì)炎癥、肺泡及間質(zhì)出血、肺不張、透明膜形成5個檢查項分別進(jìn)行0～4分的主觀定量評分：標(biāo)本無損傷0分，滿視野為4分，總肺損傷評分為上述各項之和。

1.4.2 肺組織NF-KB測定 將冷凍肺組織與液氮合并充分碾磨；混合物置入組織勻漿器，加入5ml細(xì)胞裂解液，移至4ml離心管中，2000r/min狀態(tài)下離心30s后移除示碎組織；上清液使用4ml離心管干冰孵育5min，5000r/min狀態(tài)下離心5min取沉淀（核團(tuán)）；核團(tuán)重懸于100ul胞核裂解液中，震蕩15s，干冰孵育30min；裂解后的核團(tuán)移至微離心試管中，14000r/min狀態(tài)下離心2min；上清液含DNA結(jié)合蛋白，液氮速凍，-80℃下保存?zhèn)溆谩２捎肳estern blot法檢測肺組織細(xì)胞NF-KBp65的表達(dá)。檢測組核蛋白中NF-kBp65的表達(dá)差異。

表1 病理學(xué)結(jié)果比較圖 （±s）

表1 病理學(xué)結(jié)果比較圖 （±s）

分組n肺水腫炎癥出血肺不張透明膜平均空白組（K）100.23±0.020.36±0.030.11±0.010.02±0.000.03±0.000.15±0.02模型組（L）103.11±0.253.15±0.232.96±0.172.37±0.112.66±0.132.85±0.18 t-9.9969.9949.9979.9919.9929.994 P-＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05

1.4.3 支氣管肺泡灌洗液中TNF-a、IL-1β的ELISA測定

采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定支氣管肺泡灌洗液中TNF-a、IL-lβ的含量。

2.結(jié)果

2.1 病理學(xué)結(jié)果

模型組（L組）肺水腫、肺泡及間質(zhì)炎癥、肺泡及間質(zhì)出血、肺不張、透明膜形成5個檢查項評分顯著高于空白組（K組），具有顯著差異（P＜0.05）。詳見表1。

圖1 模型組大鼠典型切片

2.2 肺組織NF-KB測定結(jié)果

空白組（K組）未檢測出肺組織NF-KB陽性，模型組（L組）均檢測出肺組織NF-KB陽性，t=9.999，P＜0.05，存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異，見表2。

表2 兩組肺組織NF-KB測定結(jié)果對比表 [n（%）]

2.3 支氣管肺泡灌洗液中TNF-a、IL-1β的ELISA測定結(jié)果

空白組（K組）未檢測出TNF-a陽性，檢測出1例（10.0%）IL-1β陽性，模型組（L組）檢測出2例（20.0%）TNF-a陽性，檢測出7例（70.0%）IL-1β陽性，t＞9.000，P＜0.05，存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異，見表3。

表3 兩組支氣管肺泡灌洗液中TNF-a、IL-1β結(jié)果對比表 [n（%）]

3.討論

本文研究數(shù)據(jù)中，急性肺損傷大鼠的TNF-a陽性數(shù)據(jù)顯著高于空白組。證實急性肺損傷過程較容易形成肺部的惡性腫瘤。同時，急性肺損傷大鼠的IL-1β表現(xiàn)顯著高于空白組說明急性肺損傷患者患肺炎的概率顯著高于普通患者。肺組織NF-KB監(jiān)測及肺組織病理監(jiān)測并未給出典型性的監(jiān)測對比結(jié)構(gòu)，其監(jiān)測結(jié)果可以支持本文研究中肺急性損傷大鼠罹患肺部腫瘤及肺部炎癥的概率顯著增加。