嘉興市主栽葡萄品種中主要病毒病原的檢測

陳婕，曹奎榮，王曄青，孫祥良*

(1.嘉興市農業科學研究院，浙江 嘉興 314016； 2.嘉興市農業經濟局，浙江 嘉興 314050)

葡萄(VitisviniferaL.)是嘉興市種植面積最大的果樹之一，在嘉興市農業經濟中占有重要地位[1]。隨著葡萄產業迅猛發展，葡萄栽培面積和苗木繁育數量急劇增加，與此同時，主要通過苗木和繁殖材料傳播的病毒病害也進一步擴展蔓延，危害日益嚴重。由于葡萄長期進行無性繁殖，容易感染和積累多種病毒，并隨著苗木和接穗的調運不斷擴散，導致果實品質不斷下降、嫁接成活率降低，樹體逐年衰退，給葡萄的優質高產帶來嚴重的影響。

目前，已報道的侵染葡萄的病毒約65種[2]，由這些病毒引起的病害中，分布最廣、危害最重的主要有葡萄卷葉病、葡萄扇葉病、葡萄斑點病和葡萄皺木復合病[3]。因此，本研究利用RT-PCR檢測結合PCR產物測序的方法，對嘉興市葡萄主栽品種進行病毒病原檢測，以期對嘉興地區主栽葡萄品種的病毒病種類、帶毒率進行系統的了解，并為以后無病毒苗木的繁育及推廣工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從嘉興市的南湖區、秀洲區、嘉善縣、海鹽縣和桐鄉市等5個縣區采集6個葡萄品種共162份樣品，包括藤稔47份，紅地球38份，醉金香34份，陽光玫瑰33份，早生內瑪斯6份和夏黑4份。春天采集嫩葉，采集方法是在新梢生長期隨機選擇植株生長點周圍的嫩葉進行采集。秋天在休眠期采集成熟枝條韌皮部，樣品采集后置于密封袋，并注明采集日期和地點。

1.2 試劑

用于檢測葡萄扇葉病毒(Grapevine fanleaf virus，GFLV)、葡萄卷葉相關病毒1(Grapevine leafroll-associated virus 1，GLRaV-1)、葡萄卷葉相關病毒3(Grapevine leafroll-associated virus 3，GLRaV-3)、葡萄病毒A(Grapevine virus A，GVA)、葡萄病毒B(Grapevine virus B，GVB)沙地葡萄莖痘病毒(Grapevine rupestris stem pitting-associated virus，GRSPaV)和葡萄斑點病毒(Grapevine fleck virus，GFkV)等6種病毒[4]的特異性引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列信息見表1。反轉錄試劑盒購自美國Promega公司，PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，其他試劑均為國產或進口分析純試劑。

1.3 儀器

樣品粉碎所用Tissuelyser-64組織研磨儀，購自上海凈信實業發展有限公司；PCR擴增所用TC-XP-D PCR儀，購自杭州博日科技有限公司；凝膠成像系統購自上海培清科技有限公司。

1.4 檢測方法

RNA提取：參照范旭東等[5]的方法，在此基礎上用組織研磨儀研磨樣品，以便節約時間。

表1 用于葡萄主要病毒病原RT-PCR檢測的引物

RT-PCR：逆轉錄cDNA鏈的合成在500 μL無酶離心管中進行，總體系為20 μL。第一步：離心管中依次加入DEPC水7.0 μL，6 bp隨機引物(TaKaRa公司)1.0 μL，總RNA 2 μL，混勻并瞬時離心后，95 ℃水浴7 min，冰上放置3 min。第二步：離心管中繼續依次加入5×M-MLV緩沖液 4.0 μL，DEPC水4.0 μL，10 mmol·L-1dNTP 1.0 μL，200 U·μL-1M-MLV酶0.5 μL，50 U·L-1RNase Inhibitor 0.5 μL。將所有試劑混勻并瞬時離心后，置于37 ℃水浴1.5 h。反應完成后將產物用于PCR擴增或置于-20 ℃保存備用。

PCR擴增：PCR反應體系為25 μL，分別加入無菌去離子水18.75 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，10 mmol·L-1dNTP 0.5 μL，10 μmol·L-1的上下游引物(表1)各0.5 μL，5 U·μL-1r-Taq0.25 μL，cDNA 2 μL。擴增反應程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，各引物相應退火溫度條件下30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環；72 ℃ 10 min。

PCR產物純化與測序：將擴增到的目的片段進行切膠回收，用北京艾德萊瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒進行純化，純化后的產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。測序結果在NCBI網站進行序列比對。

2 結果與分析

2.1 6個品種葡萄的帶病毒狀況

RT-PCR檢測結合PCR產物測序結果表明(表2)，162個葡萄樣品帶毒率高達91.4%(148/162)，其中單一病毒侵染率為30.9%(50/162)，兩種及兩種以上病毒復合侵染率為60.5%(98/162)：2種、3種、4種及5種病毒復合侵染率分別為34.6%(56/162)、14.8%(24/162)、7.4%(12/162)和3.7%(6/162)。除紅地球(帶毒率63.2%)以外，其他5個葡萄品種(藤稔、醉金香、陽光玫瑰、早生內瑪斯和夏黑)的帶毒率均為100%。

表2 162份葡萄樣品病毒檢測結果

2.2 7種病毒的檢出率以及在不同葡萄品種上的侵染率

對7種病毒的檢測結果分析表明(表2)，葡萄扇葉病毒GFLV在所有樣品中均未檢測到；引起葡萄卷葉病的GLRaV-1檢出率為1.2%(2/162)，僅在陽光玫瑰樣品中檢測到陽性，而同樣引起卷葉病的GLRaV-3的陽性率為34.6%(52/162)，該病毒在除夏黑以外的5個品種中均檢測到陽性樣品；引起皺木復合病的GRSPaV、GVA和GVB三種病毒的檢出率分別為29.6%(48/162)、36.4%(59/162)和11.1%(18/162)；引起葡萄斑點病的GFkV的檢出率最高，為84%(136/162)。但這些病毒在不同品種上的侵染率無明顯偏向性。6種病毒RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示。

3 討論

葡萄為多年生果樹，一旦被病毒侵染便終生帶毒，且無有效化學藥劑能控制[6]。葡萄病毒檢測技術的應用是實現葡萄無毒化栽培的重要保障，本研究利用RT-PCR分子檢測技術對嘉興市不同縣區的主栽葡萄品種的帶病毒狀況進行檢測分析，結果發現6個主栽品種的帶毒率均較高，且復合侵染現象嚴重。生產上，如果對病毒病不加以重視，將會對許多優良品種的產量和品質造成嚴重威脅，影響果農經濟收入。因此，在新品種引進時，要做好病毒檢疫檢測，保證苗木的質量，同時注意控制新老果園的距離，降低昆蟲傳毒的概率。

圖1 6種病毒RT-PCR產物瓊脂糖凝膠電泳