分子生物學方法在毒萵苣及其近似種上的應用

鄭煒，趙雷，劉斌

(寧波檢驗檢疫科學技術研究院，浙江 寧波 315000)

毒萵苣是一種危險性較大的有毒雜草，不僅嚴重危害糧食作物的生產安全，而且易引起人畜中毒，近年來國內外學者對其形態特征、危害性、生態、生物學特性等進行了系列研究。郭水良等[1]對檢疫性雜草毒萵苣的光合特征及其入侵地群落學進行了生態調查；孫立彥等[2]對山萵苣進行了核型分析研究；范明松等[3]從山萵苣植株中分離并鑒定出13個化合物，為醫藥化合物的開發提供了條件；王棟等[4]測定了蒙山萵苣根、葉、莖的浸提液對4種草坪雜草種子萌發及幼苗生長的影響；畢志明等[5]從多裂山萵苣的根中分離鑒定出7種化合物；梁照文等[6]對毒萵苣及其近似種進行了EST-SSR標記的開發，構建了11個毒萵苣及其近似種的系統發育樹。

DNA分子標記技術為近年來進展最迅速的學科前沿之一，已被廣泛應用于多個物種的種類鑒定。而毒萵苣及其近似種在這方面的研究基本還處于空白。為此，本研究選取了ITS區作為研究對象，收集了以毒萵苣為主的幾種萵苣屬植物，設計了一對特異性引物，對其rDNA-ITS區進行了PCR擴增，并進行了測序驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料1號山萵苣、2號毒萵苣、3號萵苣均采自寧波北侖，4號毒萵苣采自河南新縣。

1.2 DNA提取

采用高效植物基因組DNA提取試劑盒DNeasy Plant Mini Kit提取DNA，參照試劑盒說明書進行操作。

1.3 引物設計

根據GenBank中毒萵苣的現有序列，設計1對引物，上游引物為ATGCGATACTTGGTGTGAAT，下游引物為AGTTTCTTTTCCTCCGCTT，退火溫度為53 ℃。

1.4 rDNA-ITS區片段PCR擴增

PCR采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase 20 μL反應體系：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，Forward Primer 0.8 μL，Reverse Primer 0.8 μL，FastPfu Polymerase 0.4 μL，Template DNA 10 ng，補ddH2O至20 μL。PCR儀為ABI GeneAmp? 9700型。

PCR反應參數為95 ℃、5 min為1個循環；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s共27個循環；72 ℃ 10 min；10 ℃保溫。PCR擴增結束后，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

1.5 純化和測序

采用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行純化回收，測序工作在上海凌恩生物科技有限公司的ABI Prism 3730 DNA自動測序儀上完成，測序引物為CAGAATCCCGTGAACCATCG。

2 結果與分析

由圖1～2可知，4種萵苣屬植物均擴增出有效的目的片段，ITS區序列長度都在300～400 bp，設計的引物通用性適用，擴增和測序成功率在100%。

圖1 Maker標記

圖2 PCR擴增

根據測序結果在GenBank中進行序列比對(圖3)可知，山萵苣序列相似度在98%，萵苣和毒萵苣相似度在99%。根據genedoc軟件比對序列，并mega做進化樹(圖4)可以看出，萵苣屬內ITS去序列種間的差異較小，大概在25個堿基左右。從進化樹看，不同采集地的毒萵苣并列成1支，山萵苣和萵苣自成1支，種間遺傳距離差異較小。

圖3 毒萵苣及其近似種序列差異

圖4 毒萵苣及其近似種遺傳進化樹

3 討論

植物DNA序列由于在不同物種、不同分類階元的系統發育研究中存在保守性差異，因此針對某一特定的系統學問題選擇相適應的分子片段是序列分析中最為關鍵的一步[7]。rDNA-ITS區序列作為一種基于測序的標記技術已應用于觀賞植物和藥用植物中。吳玲等[8]對藥用植物石蒜屬13個種(含變種)的親緣關系進行了ITS序列分析，并將其分為三大類；王東等[9]采用PCR直接測序技術進行山藥rDNA ITS區序列的測定，從分子水平上鑒定和評價道地藥材品質性狀的變異和品質差異，以及不同品種之間的親緣關系等。

本研究通過設計的引物，比較了4種萵苣屬植物的ITS區序列的差異，由于該區域屬內種間差異較小，種間的差異不很顯著，但試驗得到的該屬的ITS區序列資料在探討屬內分組、種間關系等分類價值方面具有一定的參考價值，為萵苣屬的種類鑒定和種間親緣關系提供分子生物學的理論依據。由于本研究得到的樣本數量較少，毒萵苣及其同屬內近似種的特異性差異未做鑒定，有待進一步的研究。