范氏法與王玉萬法植物纖維素測定方法探討

李朝英，鄭路,2*，莫世宇

(1.中國林業科學研究院熱帶林業實驗中心，廣西 憑祥 532600； 2.廣西友誼關森林生態系統國家定位觀測研究站，廣西 憑祥 532600)

纖維素是植物細胞壁的主要成分之一。纖維素含量是評價植物細胞機械組織發達程度及作物抗倒伏、抗病蟲害能力的主要依據，還是鑒定糧食、蔬菜及纖維作物產品品質的重要指標。纖維素是自然界最為豐富的可再生資源，在造紙、涂料、聚合物等方面有廣泛應用[1-3]。纖維素準確定量分析方法的建立對纖維素的開發利用有著重要作用。當前，纖維素含量測定方法主要有NREL法、王玉萬法、范氏法。NREL法所用的高效液相色譜儀可對不同極性或不同比例溶液中的多種成分進行準確檢測分析，但儀器昂貴，尚未普及。王玉萬法和范氏法以蒽酮比色法或重量法檢測纖維素含量，檢測設備簡單，適用于大多數實驗室[4-5]。其中，蒽酮法的測定原理是，纖維素為β-葡萄糖殘基組成的多糖，在酸性條件下加熱分解的β-葡萄糖與蒽酮脫水縮合，生成黃色的糠醛衍生物，由其顏色深淺可定量測定纖維素含量高低。重量法的測定原理是，將樣品經酸性洗滌劑消煮所得酸性洗滌纖維(ADF)加硫酸水解纖維素，抽濾清洗后殘渣與ADF的差值即為纖維素含量[6-7]。

現期研究多以范氏法檢測飼料等植物纖維素、膳食纖維素含量，但有關范氏法測定纖維素含量的影響因素的討論分析尚未見報道。同時，重量法和蒽酮比色法測定纖維素含量的比較分析也未見報道。王玉萬法與范氏法在測定纖維素時，樣品消煮用的洗滌劑、消煮時間及消煮方式均不同，兩種方法的樣品處理程序對纖維素測定結果的影響尚不明確。鑒于此，本試驗對范氏法中樣品消煮時間及硫酸濃度、加硫酸靜置時間進行討論分析，探討影響范氏法測定纖維素含量的因素，同時對比分析范氏法-重量法和范氏法-蒽酮法、王玉萬法-重量法和王玉萬法-蒽酮法測定植物纖維素的含量，以期為實驗室準確測定植物纖維素含量，科學選擇適宜的測定方法提供可行的參考指導。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

硫酸，丙酮，十六烷三甲基溴化銨，酸性洗滌劑(20 g十六烷三甲基溴化銨溶于1 000 mL的0.5 mol·L-1硫酸中)，十氫化萘，丙酮，蒽酮，葡萄糖，中性洗滌劑(18.6 g乙二胺四乙酸二鈉和6.8 g硼酸溶于少量水中，加入含有30 g十二烷基硫酸鈉和10 mL乙二醇乙醚、4.56 g無水磷酸氫二鈉的溶液，定容至1 000 mL)。以上試劑均為分析純級別。

電子分析天平(精確至十萬分之一克)，石墨加熱板，真空泵，馬弗爐，烘箱，Fibertec8000纖維素分析儀。

1.2 樣品采集與處理

2017年4月于廣西友誼關森林生態系統國家定位觀測研究站在熱帶林業實驗中心伏波實驗場采集馬尾松(Pinusmassoniana)人工林內的馬尾松側枝(以下簡稱馬枝)、2年生桉樹(Eucalyptusrobusta)人工林內的桉樹側枝(以下簡稱桉枝)、佛肚竹(Bambusaventricosa)側枝(以下簡稱竹枝)，以及林緣生長的鬼針草(Bidenspilosa)全株(以下簡稱草株)。植物樣品在干燥箱中65 ℃烘干后粉碎，過18目篩(粒徑≤1 mm)，裝袋保存備用。

1.3 測定方法

1.3.1 范氏法-重量法

稱取樣品0.250 0 g，加入25 mL酸性洗滌劑，加5滴十氫化萘，瓶口加漏斗，保持小沸一定時間，趁熱倒入已知質量的G2玻璃坩堝抽濾，并用熱水沖洗殘渣至濾液無泡沫且呈中性。用丙酮沖洗殘渣至濾液呈無色，抽凈丙酮并烘干稱重。倒入3 mL的72%硫酸，如硫酸滲濾下去則及時補加，室溫放置3 h后用熱水沖洗到中性，收集濾液，并定容到200 mL。殘渣于105 ℃烘箱中烘干稱重，計算含量。

按上述方法進行操作，將消煮時間分別設置為1.0、1.5、2.0 h，或將硫酸濃度分別設置為68%、70%、72%、75%，進行對比試驗。

1.3.2 王玉萬法-重量法

稱取樣品0.500 0 g，加入50 mL中性洗滌劑，在100 ℃高壓鍋中保溫1 h，以2號砂芯漏斗過濾至濾液呈中性，殘渣用丙酮洗兩次。殘渣轉移到50 mL比色管中，加入50 mL的2 mol·L-1鹽酸溶液，100 ℃高壓鍋保溫50 min，以G2砂芯坩堝過濾至濾渣呈中性，用丙酮洗2次，加入72%硫酸5 mL，常溫水解3 h，加水45 mL，室溫過夜。之后烘干、稱重、灰化操作同1.3.1節。

1.3.3 范氏法-蒽酮法

將1.3.1節收集的濾液抽取1 mL，稀釋至10 mL。抽取1 mL，加入4 mL蒽酮試劑，沸水浴10 min，冷卻后于620 nm處測定。抽取0.1 mg·mL-1葡萄糖標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL，分別加入1、0.8、0.6、0.4、0.2 mL水，補足1 mL，加4 mL蒽酮試劑，沸水浴10 min，冷卻后于620 nm處測定，所測結果乘以0.9。

1.3.4 王玉萬法-蒽酮法

將1.3.2節收集的濾液抽取1 mL，同1.3.3節重復操作。

1.4 數據處理

試驗數據采用Microsoft Excel 2003軟件進行整理及繪圖，使用SPSS 17.0進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 消煮時間對范氏法-重量法測定的影響

由圖1可見，消煮1 h所測ADF及纖維素含量偏高，消煮1.5 h所測ADF及纖維素含量有所下降，與消煮2 h的趨于一致。這是因為：樣品消煮1 h時，其中的多糖物質未被酸性洗滌劑充分溶解，導致所測ADF中包含了殘留的多糖物質，加硫酸后，殘留多糖及纖維素水解，故所測纖維素偏高；樣品消煮1.5～2 h，植物組織中的多糖物質溶解充分，加硫酸后，纖維素水解充分，所測纖維素含量不受多糖干擾，故所測結果更加準確。

圖1 不同消煮時間對測定結果的影響

消煮1 h所測ADF及纖維素的標準差均>2%，而消煮1.5～2 h所測ADF及纖維素的相對標準差均<2%，這說明消煮1.5～2 h后，測定的ADF及纖維素含量離散度較小，誤差較小。可見，樣品消煮1.5～2 h有利于纖維素含量的準確測定。

2.2 硫酸濃度對范氏法-重量法測定的影響

由圖2可見，加68%、70%硫酸時所測纖維素偏低，加72%、75%硫酸時所測纖維素含量結果較一致。這可能是因為68%、70%的硫酸未能充分水解纖維素，72%、75%的硫酸水解纖維素更充分。同時，加68%、70%硫酸所測纖維素的標準差>2%，而加72%、75%硫酸所測纖維素的標準差<2%。說明用72%、75%硫酸所測的纖維素含量離散度小，檢測精密度更優。

圖2 不同濃度硫酸對測定結果的影響

2.3 不同方法測定結果的比較

由表1可見，范氏法-重量法與王玉萬法-重量法所測結果的相對標準偏差均<4%，而范氏法-蒽酮法與王玉萬法-蒽酮法的標準偏差均>4%。可見，范氏法-重量法與王玉萬法-重量法所測結果的精密度優于范氏法-蒽酮法與王玉萬法-蒽酮法。整體來看，重量法所測結果大于蒽酮法的，尤其是在草株上，重量法的測定結果顯著高于蒽酮法。重量法操作簡單，檢測誤差易于控制。蒽酮法的待測液來自重量法的檢測系統，但后續操作煩瑣，檢測干擾多且不易控制，檢測誤差高于重量法。

表1 不同方法的測定結果對比 %

注：同行數據后無相同字母的表示差異顯著(P<0.05)。

對范氏法與王玉萬法以重量法所測的纖維素含量作擬合(圖3)，2種方法所測結果趨勢一致，相關性良好。這說明王玉萬法與范氏法以不同洗滌劑及程序處理樣品，但兩者均能充分溶解植物組織中的多糖，避免殘留在ADF中，不致對纖維素含量測定造成干擾。

圖3 范氏法與王玉萬法所測纖維素含量的相關性

3 小結與討論

本研究表明，范氏法-重量法測定纖維素時，樣品適宜的消煮時間為1.5～2 h，適宜的硫酸濃度為72%～75%。范氏法與王玉萬法以重量法所測纖維素含量結果趨于一致，精密度良好。重量法操作簡單，易于控制，精密度高于蒽酮法，是測定植物纖維素的優選方法。

GB/T 20805—2006和GB/T 2677.8—1994多以稻殼、花生殼類農副產品為樣品，消煮1 h后，以72%硫酸水解纖維素。本試驗發現，適宜消煮時間長于1 h。這是因為本試驗以喬木為樣品，組織細胞致密，洗滌劑浸潤擴散用時長；而以往研究多以稻殼、花生殼類農副產品為樣品，這類樣品的組織細胞疏松，洗滌劑易于浸潤。本試驗提出的消煮時間適用的樣品范圍更廣泛。本試驗提出的硫酸濃度范圍較以往研究寬泛，更有利于操作。蒽酮法中，顯色劑配制時間長短及加入快慢等都會影響檢測，且顯色劑專一性差，纖維素水解過程中木糖也隨之水解，會干擾檢測。因此，蒽酮法的檢測誤差難以避免，且重復性較重量法欠佳[8-10]。