高分辨質譜及組學分析在小曲白酒風味成分差異鑒別上的應用

王 喆，曹倩雯，韓 嬌，孫細珍，劉源才

（1.勁牌有限公司，湖北黃石435100；2.中藥保健食品質量與安全湖北省重點實驗室，湖北黃石435100）

中國白酒中物質十分豐富，其中主體成分酒精與水的含量占總量的97%～98%，風味微量成分占2%～3%[1]，但是其種類眾多，決定了酒體的香型差異。根據化學性質不同，可以將酒中的風味物質分為醇類、醛類、酸類、酯類、酮類化合物、硫化物、縮醛類化合物、吡嗪類化合物、呋喃類化合物、芳香族化合物以及其他化合物。白酒中的各種風味物質含量從每升中幾納克到幾百毫克不等，對其準確定量非常困難。現有的分析方法主要有氣相色譜-質譜[2-3，11-12]、多維氣相色譜-質譜[4-5]、氣相色譜-聞香[6-8]、二維氣相色譜-飛行時間質譜[9-10]，以上分析方法主要基于氣相色譜與質譜串聯的分析方法，分析的對象以揮發、半揮發類物質為主。白酒中還有一部分不揮發的物質，其中大部分不揮發物質以酸類物質為主，是白酒中重要風味物質，構成白酒風味的骨架成分[13-14]，基于氣相色譜的分析方法無法進行檢測。小曲白酒作為中國保健酒第一品牌的中國勁酒的主要原料，為了不斷提升中國勁酒口感與品質，對其揮發性成分做了較為系統的研究，對其不揮發風味成分的研究才剛剛開始。

新工藝原酒其生產過程是采用機械化生產工藝，生產用酒曲使用的是純種培養，然后按比例混合的混合曲，其保持了傳統工藝原酒風格，同時口感更加純凈。為了明確兩種原酒口感差異的物質基礎，本工作采用超高效液相色譜和基于Orbitrap高分辨質譜技術[17，19，24]的臺式質譜儀，結合組學分析[15-16，18]軟件 Compound Discoverer2.0，對不同工藝生產的小曲白酒中的不揮發風味物質進行分析，聚焦于其中的標志性差異化合物，期望為小曲白酒釀造工藝升級、釀造微生物選擇，提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：勁牌有限公司生產。A酒樣為新工藝混合曲生產原酒，生產線上抽取10個批次；B酒樣為傳統工藝傳統曲生產原酒，生產線上抽取10個批次。

試劑：甲酸銨、甲醇、甲酸，以上試劑均為色譜純（國藥集團化學試劑有限公司）、高純氮氣（99.999%，武鋼生產）。

儀器設備：Ultimate 3000 RSLC超高效液相色譜儀聯用Q Exactive MS臺式高分辨質譜儀（配有Compound Discoverer 2.0數據處理系統），美國賽默飛世爾公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試品溶液制備

取0.5 mL酒樣過0.22 μm有機膜，作為供試品溶液待用。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Accucore C18(100×2.1 mm，2.6μm)；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL；流動相：水相（W）5 mM甲酸銨以及0.1%甲酸水溶液，有機相（M）5 mM甲酸銨以及0.1%甲酸甲醇溶液；A相流動相組成為98∶2（W∶M），B相流動相組成為2∶98（W∶M），A相濃度洗脫梯度：0～1 min，100%；1～6 min，1000%～50%；6～15 min，50%～0%。1.2.3 質譜條件

離子源（HESI，正負切換）；噴霧電壓：3000 V(+)，2500(-)；離子源溫度：300 ℃；鞘氣氣壓：35 arb；輔助氣壓：10 arb；毛細管溫度：350℃。質譜掃描模式：Full MS-ddMS2(TOP 3)；掃描范圍：100～900 m/z；分辨率：70000(FWHM)at m/z 200，Full MS-17500(FWHM)at m/z 200，MS/MS；掃描間隔：2.0 m/z。

1.3 數據分析

采用 Compound Discoverer 2.0（簡稱 CD2.0）對組分進行提取、過濾及統計學分析。

2 結果與分析

2.1 色譜分離條件考察

為保證白酒樣品中盡可能多的成分能夠有效地被測定，對色譜分析條件進行了摸索，從圖1可以看出，絕大多數化合物出峰時間在5 min之后，且各組分分布均勻，表明色譜條件選擇合適。從圖2可以看出，橫坐標為保留時間，縱坐標為分子量，結果顯示在所采用的色譜條件下，化合物的出峰時間合適，其分布較為均勻。

圖1 兩種工藝酒樣的輪廓圖

2.2 數據重現性考察

在代謝組學[20-22，25]相關試驗中，方法的重現性至關重要，需要保證數據在質量精度、保留時間及響應強度等方面具有很好的重現性。本實驗在進樣序列中穿插了質控樣品，對系統的穩定性進行了考查。質控樣品的相關檢測數據見表1。

圖2 不同化合物保留時間分布圖

表1 質控樣檢測數據

從表1可以看出，實際檢測過程中，保留時間偏差≤0.05 min，峰面積的RSD為2.1%，質量精度的偏差≤1.5 mg/L，數據重現性符合要求。

圖3為化合物（m/z149.09609）提取后的色譜圖，利用其保留時間和峰面積，考查色譜的穩定性；圖4為化合物（m/z149.09609）質譜圖，利用其m/z考察質譜的穩定性。

圖3 化合物（m/z149.09609）XIC圖

從圖3、圖4可以看出，在整個進樣周期內，以某一化合物（m/z149.09609）理論值考查的保留時間(RT)偏差＜0.05 min，峰面積的RSD為2%左右，質量精度的偏差在1.5 mg/L以內，表明系統有良好的穩定性、重現性和質量精度。

圖4 化合物質譜圖

2.3 不同原酒風味物質差異統計學分析

采用CD 2.0軟件對組分峰進行提取和過濾，確定以P-Value＜0.05，Fold Change=2對峰進行過濾。Fold Change=2排除差異較小的化合物，PValue統計學中的假設檢驗，p值是將觀察結果認為有效即具有總體代表性的犯錯概率。

圖5 兩種原酒的火山圖

圖5為兩種工藝原酒組分分析的火山圖，從圖5可以看出，A組內的組分差異要比B組內組分差異要小。是由于傳統工藝所用酒曲為自然接種的傳統曲，其中混入了雜菌，導致酒體中的雜味物質較多。新工藝原酒生產采用的機械化生產工藝和純種培養的混合曲，生產過程控制較好，故酒體雜質少，且酒的品質均一和穩定性要好。

表2 差異化合物鑒定表

主成分分析（PCA分析），是一種分析、簡化數據集的技術。主成分分析經常用于減少數據集的維數，同時保持數據集中的對方差貢獻最大的特征。這是通過保留低階主成分，忽略高階主成分做到的。這樣低階成分往往能夠保留住數據的最重要方面。

通過對有顯著性差異的化合物做PCA分析，將樣品的特征量壓縮，在低緯度空間反映樣品之間的關系。

圖6 兩種原酒PCA分析圖

圖6是兩種原酒的組分PCA分析圖，從圖6可以看出，兩種樣品可以清晰的按照生產工藝區分為兩組，說明不同生產工藝所生產的樣品所含成分有一定差異，且B組樣品組內差異比A組大。

2.4 差異化合物鑒定

找出兩組樣品中有差異的化合物，可以明確兩種原酒口感差異的物質基礎，為工藝以及酒曲配方升級提供依據。根據標記物的精確質量數、同位素分布和二級碎片離子等信息，采用CD2.0軟件和ChemSpider[19-20]、mzCloud 網絡數據庫[24]對有差異的化合物進行了鑒定和確證。鑒定結果見表2。

圖7是兩種不同工藝原酒中標志性差異化合物的峰面積箱型圖，以峰面積差在兩倍以上為篩選條件，篩選出了7種標志性差異成分。

從圖7a至圖7f可以看出，苯乙酮、戊二酸、茴香腦、香草酸、癸二酸二甲酯、2,6-二甲基-4-吡喃酮為B組內的標志性成分，顯著高于A組。從圖7g可以看出，4-異丁基苯甲酸為A組內標志性成分，顯著高于B組。

3 結論

對小曲白酒的質量鑒別現主要采用對揮發性風味物質的分析、鑒別。為了評價小曲白酒中不揮發性物質對小曲白酒品質的影響，采用超高效液相色譜和Orbitrap高分辨質譜儀，對不同工藝小曲白酒中不揮發性成分作了分析。通過組學分析軟件從眾多不揮發性成分中篩選出差異明顯的物質，明確了新工藝混合曲與傳統工藝曲生產的原酒之間差異的不揮發性物質基礎。根據其精確質量數、同位素分布、二級碎片離子信息，采用CD2.0軟件和chemspider進行了鑒定，其為苯乙酮、戊二酸、茴香腦、香草酸、癸二酸二甲酯、2,6-二甲基-4-吡喃酮、4-異丁基苯甲酸7種化合物。

通過不揮發性物質的分析和采用組學分析的手段，對不同工藝的小曲白酒的鑒別，能夠明顯區分兩種工藝小曲白酒，為小曲白酒的品質鑒別、生產一線原酒分級提供了一種解決思路，能有效緩解生產一線原酒品評員不足的問題。

注：a.標記物1在兩組中峰面積箱型圖；b.標記物2在兩組中峰面積箱型圖；c.標記物3在兩組中峰面積箱型圖；d.標記物4在兩組中峰面積箱型圖；e.標記物5在兩組中峰面積箱型圖；f.標記物6在兩組中峰面積箱型圖；g.標記物7在兩組中峰面積箱型圖。