檳榔提取物質量標準研究

朱曉瑜，邢建華，許啟太

(海南綠檳榔科技發展有限公司，海南 定安 571200)

檳榔是棕櫚科檳榔屬植物檳榔(Areca catechu L.)的成熟果實，檳榔，始載于晉代著名醫家李當之的〈藥錄〉中[1-2]。原產于馬來西亞，在我國栽培已有1500多年歷史[3]。檳榔提取物(Areca extract)是以檳榔果為原料，經提取分離制成的植物提取物[4]，該提取物作為中間體或者原料用于藥品、保健品等[5]。歷代醫家在臨床當中不斷總結，發現檳榔具有很多不可代替的療效，在歷次出版的《中華人民共和國藥典》均有收錄。2015年版《中國藥典》記載：檳榔(檳榔干燥成熟種子)具有殺蟲、消積、行氣、利水、截瘧的功效；大腹皮(檳榔干燥果皮)具有行氣寬中、行水消腫的功效[6]。現代科學研究表明檳榔對神經系統[7]、內分泌系統[8]和消化系統[9]具有保護作用。目前尚未檢索到檳榔提取物國內、外標準，對此，本課題組初步建立其質量標準，擬為檳榔提取物的質量控制提供依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

FA2004型分析電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；BS-6K 型電子天平(上海友聲衡器有限公司)；KQ-100型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司生產)；SX-2.5-10 型馬弗爐(北京中興偉業儀器有限公司)；DHG-9240A烘箱(江蘇江東精密儀器有限公司；Agilent 1260系列高效液相色譜儀(附紫外檢測器)，色譜柱：強陽離子交換鍵合硅膠柱Phenomenex Luna SCX Column，250 mm×4.6 mm，5 μm。

1.2 藥品及試劑

檳榔提取物：海南綠檳榔科技發展有限公司提供(樣品批號為：20151208、20151209、20151223、20160110、20160113、20160302、20160806、20161022、20170115、20170118)；氫溴酸檳榔堿對照品：中國食品藥品檢定研究院所提供，111684～201401。

檳榔提取物所用檳榔果采集于海南省萬寧市，由河南大學中藥研究所李昌勤教授鑒定為棕櫚科檳榔屬植物檳榔(Areca catechu L.)的成熟果實。

水為純凈水，甲醇和乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 感官要求

取本品三批樣品，嗅其氣味和嘗其滋味；另取試樣適量置于白色瓷盤中觀察其色澤、外觀，并檢查有無異物，結果見表1。

表1 檳榔提取物感官要求

根據觀察結果，本標準規定檳榔提取物的感官要求描述為：本品為淺黃色至棕褐色粉末，色澤均勻；具有檳榔特殊氣味，味微澀；外觀均勻，無肉眼可見雜質。

2.2 鑒別實驗

參照中華人民共和國藥典(2015年版)一部檳榔中鑒別項方法，制定檳榔提取物鑒別方法。

取氫溴酸檳榔堿對照品，加甲醇制成每1 mL含1.5 mg的溶液，作為對照品溶液。取檳榔提取物粉末2.5 g，置50 mL容量瓶中，加適量甲醇,超聲(150 W)處理20 min，用甲醇定容，靜置，即得供試品溶液。分別吸取供試品溶液、對照品溶液各5 μL，點于硅膠G板上，展開劑為V(環己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(濃氨試液)=7.5∶7.5∶0.2，展開約8 cm，取出晾干。置碘蒸氣中熏至斑點清晰，置可見光下檢視。結果：供試品薄層色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯示相同的褐色斑點。

2.3 檳榔堿含量測定

檳榔堿是檳榔提取物中重要的活性成分之一，參考《中國藥典》2015年版一部檳榔【含量測定】項，采用高效液相色譜法測定。

色譜柱：SCX-強陽離子交換樹脂柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相∶V(乙腈)∶V(0.2%磷酸)= 55∶45(濃氨試液調節pH值至3.8)溶液；檢測波長：215 nm；柱溫：室溫；流速：1.0 mL·min-1；理論塔板數按氫溴酸檳榔堿峰計算應不低于3000。

對照品溶液制備 取氫溴酸檳榔堿對照品適量，精密稱定，加流動相制成1 mL含0.1 mg的溶液，即得(檳榔堿重量=氫溴酸檳榔堿重量/1.5214)。 供試品溶液制備 取本品約0.25 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加50%乙腈溶液適量，超聲處理30 min，并用50%乙腈溶液定容至刻度，搖勻，過濾。取續濾液5 mL，置25 mL量瓶中，加50%乙腈溶液定容至刻度，搖勻，即得。

分別吸取供試品溶液、對照品溶液及空白流動相各 10 μL，按“3.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，結果供試品色譜中，在與對照品色譜相同保留時間有對應的峰，空白流動相溶液無干擾。表明系統適應性較好。如圖2、圖3、圖4 所示。

圖2 檳榔提取物

圖3 氫溴酸檳榔堿對照品

圖4 空白流動相

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖。

供試品中檳榔堿含量以質量分數W計，數值以%表示，按公式E.1計算。

式中：W——檳榔提取物中檳榔堿含量，%；

A1——供試品溶液中檳榔堿的峰面積；

A0——對照品溶液中檳榔堿的峰面積；

C2——供試品溶液中檳榔提取物的濃度(mg·mL-1)；

C0——對照品溶液中檳榔堿的濃度(mg·mL-1)。

本品按干燥品計算，含檳榔堿(C13H18O7)不得少于6.0%。

精確稱量供試品(批號：20160110)樣品6份，按"3.2.2"項下處理，并按照色譜條件進樣10 μL，記錄峰面積，計算檳榔堿的含量和RSD值，RSD為1.48%，表明本實驗方法重復性好。見表2。

表2 重復性試驗結果

精密稱量供試品(批號：20160110)樣品，在不同日期、不同分析人員、不同儀器測定6次，每次10 μL，結果檳榔堿含量的RSD為1.63%，表明儀器精密度良好，可以準確反映物質的量。見表3。

表3 中間精密度試驗(n=5)

取供試品(批號：20160302)制成供試液，分別于0、2、4、6、12、24 h，進樣10 μL，記錄色譜圖，結果供試品中檳榔堿峰面積的RSD為2.77%(n=6)，表明供試液中檳榔堿在24 h內基本穩定。見表4。

表4 穩定性試驗結果

稱取已知檳榔堿含量的檳榔提取物樣品(批號：20160302)約0.25 g，共6份，按“3.2.2”項下制備供試品溶液，分別置50 mL量瓶中，加50%乙腈溶液適量，超聲處理30 min，并用50%乙腈溶液定容至刻度，搖勻，過濾。取續濾液5 mL，置25 mL量瓶中，加50%乙腈溶液定容至刻度，搖勻即得，測定樣品中所含檳榔堿含量。另取50 mL量瓶中續濾液5 mL，分別置于25 mL量瓶中，分別加入按“3.2.1”項下配置的對照品溶液(含檳榔堿濃度0.13146 mg·mL-1)12.5 mL，50%乙腈溶液定容至刻度，混合均勻即得進樣樣品25 mL，按照上述色譜條件進樣10 μL，檳榔堿的平均加樣回收率為97.5%，其RSD值為2.6%。見表5。

表5 檳榔堿回收率結果

2.3.10 線性關系試驗

精密稱取氫溴酸檳榔堿對照品適量，加流動相制成1 mL含5.02 mg氫溴酸檳榔堿的溶液，即得對照品母液。然后稀釋，使對照品溶液理論含氫溴酸檳榔堿濃度分別為0.502,0.251,0.1255,0.06275,0.041833 μg·μL-1(含檳榔堿濃度=含氫溴酸檳榔堿濃度/1.5214)。每次進樣10 μL。照含量測定項下的方法測定，以峰面積為橫坐標，檳榔堿濃度(μg·μL-1)為縱坐標，繪制回歸曲線，計算線性回歸方程。結果見圖2。結果表明，檳榔堿濃度在0.02750～0.32996 μg·μL-1的范圍內成良好線性關系。

圖5 氫溴酸檳榔堿標準曲線

2.3.11 樣品測定

取本品按“2.3.2”項下制備供試品溶液，按照“2.3.1”項下色譜條件測定，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。另取氫溴酸檳榔堿對照品按“2.3.1”項下制備對照品溶液，同法測定，按“2.3.5”項下公式計算，即得。檳榔提取物檳榔堿含量測定結果見表7。

表7 檳榔提取物檳榔堿含量測定結果

表7(續)

上述方法學驗證表明，本文建立的高效液相色譜法測定檳榔堿提取物中的檳榔堿的含量，其精密度、線性關系、準確度等均符合要求，該方法穩定、可靠、可行，可以作為檳榔提取物中檳榔堿的含量測定方法，訂入本標準。

表7可見，10批檳榔提取物中檳榔堿含量按干燥品計算均不低于6.0%。因此，將本品含檳榔堿按干燥品計算不少于6.0%訂入本標準。

3 討論

本品符合感官要求；薄層鑒別色譜斑點清晰，分離度好；高效陽離子交換色譜法，流動相為乙腈-0.2%磷酸(濃氨試液調節pH值至3.8)溶液(55∶45，v/v);檢測波長215 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 mL·min-1色譜條件下，檳榔堿的分離度良好，此方法操作簡便，重復性、精密度、準確度良好；從線性回歸方程y = 3E + 07x + 102168 ，R2=0.9995可以看出檳榔堿濃度在0.02750～0.32996 μg·μL-1的范圍內成良好線性關系；檳榔堿按干燥品計算都大于6.0%，符合要求；所以，本研究建立的質量標準可以控制檳榔提取物的質量。

此次實驗從數據分析來看，結果不錯，實驗成功。目前，測定檳榔堿含量的方法主要有滴定法[10]、薄層色譜法[11]、毛細管電泳法[12]、分光光度法[13]、氣相色譜-質譜聯用儀[14]、陽離子交換色譜法[15-16]、反相高效液相色譜法[17-22]及高效液相色譜-質譜聯用法[23-24]等，但滴定法操作繁瑣，準確度不高，薄層掃描法雖然也可以測量，但是要求高。采用高效陽離子交換色譜法，分離度良好，此方法操作簡便，具有良好的專屬性和準確度，可有效控制產品質量操作簡便，快速，重現性好。可為以后類似實驗提供方法學借鑒。