基于ISSR的野生桑樹桑黃菌株遺傳多樣性分析

王偉科，袁衛東，陸 娜，宋吉玲，閆 靜

(杭州市農業科學研究院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310024)

桑黃隸屬于真菌界(Fungi)、擔子菌門(Basidiomycota)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)、桑黃屬(Sanghuangporus)，是一種珍貴的藥用真菌，因寄生于桑樹而得名，別稱桑臣、桑耳[1]?，F代科學研究證實，桑黃具有抗腫瘤、降血糖、護肝、抗炎、免疫調節、抗氧化等藥理作用，具有極高的開發利用價值[2]。桑黃屬種質鑒定、新品種選育及高效栽培技術一直是科研人員研究關注的重點[3]。在前期研究中，利用ITS (internal transcribed spacer)序列分析技術，對從杭州、麗水及安徽金寨等地采集的22個桑黃樣品進行了鑒定，成功區分出了楊樹桑黃(Fuscoporiagilva)及丁香桑黃(Inonotusbaumii)，并得到了17份桑樹桑黃(Sanghuangporussanghuang)樣品(樣品采集于不同地區的野外桑樹樹干)。鑒于ITS在種內間隔區上表現的差異較小，不適宜種內菌株的進一步區分，需利用分子標記技術進一步研究上述試驗中鑒定得到的桑樹桑黃種內遺傳多樣性。

目前，ISSR(inter simple sequence repeat)、AFLP(amplified fragment length polymorphism)、RFLP(restriction fragment length polymorphism)，RAPD(random amplified polymorphic DNA)等分子標記技術已廣泛運用于藥用植物及食用大型真菌種類遺傳多樣性鑒定[4]。ISSR分子標記技術以其高效、快速、穩定、可靠等諸多優點在物種遺傳多樣性鑒定、系統進化等多個領域得到廣泛運用。大量研究表明，ISSR分子標記技術可以用于種群間或種群內的遺傳多樣性分析[5]。在本研究中，我們擬采用ISSR分子標記技術對前期研究中獲得的17個桑樹桑黃樣品的遺傳多樣性進行分析，以期明確桑樹桑黃種內樣品之間的親緣關系。同時，為規范桑樹桑黃引種栽培、加強資源保護和品種選育打下基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

測試菌種(株)來自我國各主要桑黃真菌保藏單位，經前期ITS序列鑒定為桑樹桑黃樣品(表1)。

1.2 菌絲體培養

從培養5～7 d 的PDA培養基平板上挑取2 mm ×2 mm的菌絲塊，接種于PDA液體培養基，25～27 ℃淺層靜置培養15～20 d。然后收集菌絲體，用無菌水漂洗2次，滅菌濾紙吸干水分，用于提取基因組DNA。

1.3 基因組DNA的提取

表1桑樹桑黃真菌測試菌株來源

Table1Strains used forSanghuangporussanghuanggenetic diversity study

序號No.菌株Strain菌株來源Source of strain序號No.菌株Strain菌株來源Source of strain1S1淳安微生物研究所Chun ′an Institute of Microbiology10S11延邊農業科學研究所Yanbian Agricultural Science Institute2S2淳安微生物研究所Chun ′an Institute of Microbiology11S15杭州市食用菌協會Hangzhou Edible Fungi Association3S4四川省農科院Sichuan Academy of Agricultural Sciences12S17杭州市食用菌協會Hangzhou Edible Fungi Association4S5浙江桐廬野生采集Wild collection from Tonglu, Zhejiang13S21浙江淳安野生采集Wild collection from Chunan, Zhejiang5S6浙江桐廬野生采集Wild collection from Tonglu, Zhejiang14S22浙江淳安野生采集Wild collection from Chunan, Zhejiang6S7浙江臨安野生采集Wild collection from Linan, Zhejiang 15S23浙江淳安野生采集Wild collection from Chunan, Zhejiang7S8浙江淳安野生采集Wild collection from Chunan Zhejiang16S26浙江衢州野生采集Wild collection from Quzhou, Zhejiang8S9桐廬桐君堂藥業有限公司Tonglu Tong Jun Tang Pharmaceutical Co. Ltd.17SKHCH浙江開化野生采集Wild collection from Kaihua, Zhejiang9S10浙江桐廬野生采集Wild collection from Tonglu, Zhejiang

取0.1 g菌絲體，液氮研磨后加入2% CTAB，用于基因組DNA的提取[6]。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000 C超微量分光光度計(Thermo)檢測所提DNA濃度和純度。DNA樣品稀釋至40 ng·μL-1，用于ISSR擴增。

1.4 ISSR引物設計與合成

ISSR引物參考哥倫比亞大學公布的序列及Wolfe等[7]的文獻，從中篩選出16條合適引物，引物由北京擎科生物技術有限公司合成。引物序列見表2。

1.5 ISSR分子標記鑒定

ISSR擴增體系根據各自引物退火溫度及Mg2+濃度進行優化，優化后體系含10×PCR buffer 2 μL、25 mmol·L-1MgCl21.2 μL、10 mmol·L-1dNTPs 0.5 μL、10 μmol·L-1ISSR引物各1 μL、80 ng基因組模板DNA及1 U pfu DNA聚合酶，反應總體積20 μL。

PCR擴增程序為： 94 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，46～52 ℃ 90 s，、72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 7 min。其中，每個引物的退火溫度優先參考值為Tm值下調2 ℃。

1.6 擴增產物檢測

取目標產物10 μL，加入6×上樣緩沖液1.5 μL，混勻后于1%瓊脂糖凝膠上電泳分離。電泳緩沖液采用TAE，穩壓電泳，電壓120 V，40 min后停止電泳并拍照記錄。

1.7 數據采集分析

從凝膠成像系統得到的電泳譜帶中，選取清晰可辨的電泳條帶，以“1”和“0”記錄條帶的有或者無，在相同片段位置上存在擴增帶時，記錄為“1”，不存在時記錄為“0”，將圖形數據轉換成數字數據。并運用NTSYS-pc2.0軟件，根據SM相似系數法(coefficient)計算樣品間的遺傳相似性，用UPGMA法進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 ISSR多態性

用來擴增桑樹桑黃的16條ISSR引物中，有10條獲得的ISSR帶型較好，各引物擴增獲得的條帶片段大小范圍較大，為200～3 000 bp(表3)。這10條引物共擴增獲得904條DNA條帶，其中，多態性條帶717條。引物P816、P817、P825、P828擴增的多態性比率最高，為100%；引物P810擴增的多態性比率最低，為55.7%(表3)。

2.2 DNA指紋圖譜

在桑樹桑黃ISSR擴增DNA指紋圖譜中(圖1)，引物P825、P889分辨力最高，對桑樹桑黃基因組DNA擴增效果最好，引物P5、P812擴增條帶多態性最高，表明用該ISSR引物建立的指紋圖譜用來分析桑樹桑黃遺傳多樣性較好。

2.3 聚類分析

聚類分析結果表明，在遺傳相似系數約0.65處，17個菌株可劃分為2大類群：S4、S23、S26為一大類群；其余14個菌株為一大類群，在這一大類群中，在遺傳相似系數為0.73處，S11、S17、SKHCH各單獨聚為一類，S8，S21聚為一類，S5、S6、S7、S10、S22聚為一類，S1、S2、S9、S15聚為一類(圖2)。

2.4 遺傳相似性

17個桑樹桑黃的遺傳相似系數(表4)結果表表明，17個菌株的遺傳相似系數為0.57～0.99，平均遺傳相似系數為0.71。其中，S2與S26之間的遺傳相似系數最低，為0.58，可見S2與S26之間的親緣關系最遠。S1與S2之間的遺傳相似系數最高，為0.99，說明S1與S2之間的親緣關系最近。

表2ISSR引物參考序列

Table2Sequences of tested ISSR primers

引物編號Primer No.序列(5′→3′)Sequence (5′→3′)Tm值Tm value引物編號Primer No.序列(5′→3′)Sequence (5′→3′)Tm值Tm valueP812GAGAGAGAGAGAGAGAA49.8P974CACGAGAGAGAGAGAGA55.2P5GGATGCAACACACACACAC52.2P821TCTCTCTCTCTCTCTCCG54.9P826ACACACACACACACACC52.2P817AGAGAGAGAGAGAGAGG52.2P825ACACACACACACACACT49.8P829CACACACACACACACA49.2P823TCTCTCTCTCTCTCTCC52.2P824TGTGTGTGTGTGTGTG49.2P841GAGAGAGAGAGAGAGAYC52.6P816CACACACACACACACAT49.8P55KKRBRBRACACACACACAC46.5P828TGTGTGTGTGTGTGTGA49.8P889DBDACACACACACACAC47.4P810GAGAGAGAGAGAGAGAT49.8

表310條ISSR引物擴增結果

Table3Amplification results of 10 different ISSR primers

引物編號Primer No.擴增條帶數Number of amplified bands多態性條帶數Number of polymorphic bands多態性百分比/%Percentage of polymorphic bands片段大小Fragment length/bpP551148070.2400～2200P8101156455.7400～2200P81214310976.2200～2200P8166666100400～1600P8176060100600～2200P8256767100400～2200P8286262100400～2200P8291067267.9400～1400P889715476.1400～3000P51008383.0200～2200

M，DNA分子量標準，從上到下依次為：4、2.2、2、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 kb； S1、S2、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S15、S17、S21、S22、S23、S26、SKHCH為17個桑樹桑黃菌株。下同。M， DNA marker， The molecular weight of marker from top to bottom were 4， 2.2， 2， 1.8， 1.6， 1.4， 1.2， 1， 0.8， 0.6， 0.4， 0.2 kb， respectively; S1， S2， S4， S5， S6， S7， S8， S9， S10， S11， S15， S17， S21， S22， S23， S26 and SKHCH represent 17 wild Sanghuangporus sanghuang strains， respectively. The same as bellow.圖1 17個桑樹桑黃樣品的ISSR引物擴增圖譜Fig.1 Amplification profiles of 17 Sanghuangporus sanghuang strains by ISSR primers

3 結論與討論

用表型特征和生理生化特征等傳統方法來鑒定野生桑樹桑黃子實體需對菌株開展出菇試驗，但桑黃生長緩慢，很難在短期內獲得子實體，且其子實體表型易受外部環境影響，這些因素使得桑黃鑒定難度增加。近年來，迅速發展的DNA分子標記技術因其具有鑒定快速、不受外界環境干擾、直接反映樣品遺傳本質等優點，被越來越多地用在食藥用菌種間、種內的遺傳多樣性分析中。

圖2 17個桑樹桑黃樣本的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram of 17 strains of Sanghuangporus sanghuang

表417個桑樹桑黃菌株的遺傳相似系數

Table4Genetic similarity coefficient of 17 strains ofSanghuangporussanghuang

菌株S1S2S4S5S6S7S8S9S10S11S15S17S21S22S23S26StrainsS20.992S40.6140.622S50.6300.6380.654S60.6300.6380.6380.748S70.7320.7400.6770.8030.740S80.6300.6380.5750.7010.7640.709S90.8190.8270.6220.6850.7170.7560.717S100.6850.6930.6140.7870.8030.7800.7870.803S110.6930.7010.6220.7170.7010.7400.7480.7480.772S150.8030.7950.6220.6380.6540.7400.6690.9060.7560.701S170.6850.6930.6610.6930.7240.7170.6610.7090.7170.7240.677S210.6140.6220.6220.6690.6220.7090.7800.6380.6930.6690.6220.646S220.6540.6460.6770.7400.7400.6850.7240.7240.7950.6930.7090.748S230.6220.6140.6610.6140.6460.7010.6610.6770.6690.6460.6770.6540.5980.732S260.5830.5750.6540.6850.6850.6770.6540.6380.6610.6380.6380.6770.6380.7240.756SKHCH0.6380.6460.6140.6610.7090.6850.6610.6930.7010.6140.6930.7010.6610.7010.6380.661

本研究利用ISSR-PCR技術對經ITS分子標記鑒定后獲得的17個桑樹桑黃種內菌株的遺傳多樣性進行分析，有10條引物擴增產物多態性豐富，條帶清晰，獲得DNA條帶904條，其中多態性條帶717條。這表明桑樹桑黃種內菌株的遺傳多樣性比較豐富。用UPGMA進行聚類分析表明，在遺傳相似系數約0.65處，17份樣品可劃分為2大類群，S4、S23、S26為一大類群，其余為一大類群。這表明ISSR分子標記能有效地揭示桑樹桑黃種質資源間豐富的多態性和遺傳多樣性。

基于ISSR分子標記技術對桑樹桑黃種內菌株的遺傳多樣性及親緣關系進行分析，不僅能對桑黃開展系統進化生物學研究，也能為我國桑黃資源開發利用、品種選育、栽培技術研究提供理論依據[8]。同時，對桑黃菌株進行分類鑒定不能只依靠單一分子標記技術，需進一步結合菌絲形態、子實體特征、生理生化特性等開展系統的研究和分析，從而明確桑黃菌株之間的分類定位[9-10]。