牛抵抗素對牛肺泡巨噬細胞TLR4/MyD88非依賴信號通路基因表達的影響

陽明賢，左之才，李 碧，王 宇

(四川農業大學 動物醫學院，環境公害與動物疾病四川省高校重點實驗室，動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130)

抵抗素(resistin，RETN)首次發現于小鼠脂肪組織，是一種特異性小分子蛋白質[1]，具有胰島素抵抗作用，可調節機體血糖濃度[2-3]。抵抗素具有強烈的促炎效應，不僅影響巨噬細胞的形態，促使巨噬細胞由抗炎的M2型向促炎的M1型表達[4]，還可提高IL-1、IL-6、IL-12、TNF-a等促炎細胞因子表達，調控炎癥過程[5-6]。抵抗素促炎效應的分子機理尚不明確，有待深入研究。

Toll樣受體(toll like receptor，TLRs)是機體中一類重要的模式識別受體(pattern recognition receptors，PPRs)，其介導的通路包括MyD88依賴途徑和MyD88非依賴途徑即TRIF信號通路，不同的TLRs募集不同的接頭分子，激活不同的信號通路。TLRs中，Toll樣受體4(TLR4)最早被發現，是目前被發現唯一既能激活MyD88依賴途徑又能激活MyD88非依賴途徑的受體[7]，該類受體廣泛分布于多種免疫細胞的表面，可激活先天性免疫系統，上調促炎細胞因子表達，在炎性疾病和免疫性疾病中起著重要作用[8]。

已有研究表明，在人單核白血病細胞(THP-1)中，抵抗素可與TLR4之間發生直接相互作用，結合TLR4，通過MyD88依賴途徑激活核因子κB(unclear factor κB，NF-κB)刺激炎性細胞因子上調表達[9]。但在牛體內，尚無此類研究報道，且MyD88非依賴途徑作為Toll樣信號通路的另一重要分支，目前未有研究顯示抵抗素通過該信號通路發揮促炎效應。本試驗基于TLR4信號通路在炎癥和生理方面的重要作用，利用牛抵抗素誘導牛肺泡巨噬細胞，檢測TLR4/MyD88非依賴信號通路相關基因(TLR4、TRAM、NF-κB)mRNA表達量和L-6、1L-1β、TNF-α等促炎細胞因子水平，探討牛抵抗素通過MyD88非依賴途徑發揮促炎效應的作用機制，了解牛肺部炎癥疾病的相關分子機理，為牛肺部炎癥疾病的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

牛抵抗素由本實驗室原核表達后經內毒素去除試劑盒除去內毒素制得，牛肺泡巨噬細胞采自健康牛新鮮肺部組織。

高糖DMEM培養基，美國Hyclone公司；胎牛血清，生工生物工程(上海)股份有限公司；ELISA試劑盒，南京建成生物工程研究所；PremixTaq酶、反轉錄酶試劑盒，寶日醫生物技術(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 牛肺泡巨噬細胞的采集與分組

無菌并含有雙抗的PBS(青霉素200 U·mL-1，鏈霉素200 μg·mL-1)，4 ℃預冷處理，備用。采取眼觀無病變帶有10 cm氣管的完整健康水牛肺部，結扎氣管。PBS洗凈肺表面，將PBS經氣管灌入肺部，適當輕柔肺部，收集灌洗液，重復3次。灌洗液經200目紗布過濾，1 500 r·min-1離心10 min，收集細胞。PBS洗滌細胞，1 000 r·min-1離心10 min。加細胞培養液(DMEM培養基與胎牛血清9∶1混合，含10%胎牛血清)重懸細胞，經細菌計數，置于5%CO2、37 ℃細胞孵育箱內培養6 h，用PBS洗去未貼壁細胞，胰酶消化并重懸細胞，臺盼藍染色，計算細胞存活率。將細胞濃度調整為1×106個·mL-1，分裝于6孔板中，置于細胞孵育箱內培養3 h。 加100 ng·mL-1終濃度牛抵抗素進行誘導，陰性對照添加等體積PBS，每組設置3個平行樣。分別在誘導后的0、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0 h收集下層細胞和上清液。

1.2.2 樣品核酸提取及qRT-PCR檢測

下層細胞加1 mL Trizol反復吹打混勻，室溫靜置5 min。加200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置2 min；4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，取上清至1.5 mL Eppendorf管中，加等量異丙醇，輕輕顛倒5次，混勻；室溫靜置10 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min；棄上清，加1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，4 ℃、7 500 r·min-1離心5 min；棄上清，室溫干燥5～10 min；加30～50 μL DEPC水，溶解沉淀，-70 ℃保存備用。總RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳。按照反轉錄試劑盒說明書，進行反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板，對基因(TLR4、TRAM、NF-κB)的mRNA表達量進行檢測，引物由上海生工生物有限公司合成(表1)。cDNA進行10倍系列稀釋，制作標準曲線。反應體系：上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，PremixTaq6 μL，模板 5 μL。反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，40個循環，每個循環后檢測熒光。

1.2.3 促炎細胞因子水平檢測

細胞上清離心，按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6、1L-1β、TNF-α促炎細胞因子含量。

1.2.4 數據處理

qRT PCR結果采用2-△△CT法進行計算，用內參基因β-actin對各基因表達水平均一化，2-△△CT法計算公式：△CT=目的基因CT值-內參基因CT值，△△CT=試驗組△CT值-對照組△CT值[10]。ELISA結果采用SPSS16.0軟件進行方差分析，數據用“平均值±標準差”表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 抵抗素誘導牛肺泡巨噬細胞后TLR4/TRIF/NF-κB信號通路基因表達量差異

將每個基因陰性對照0 h的mRNA表達量設置為1，比較抵抗素不同誘導時間對牛肺泡巨噬細胞TLR4、TRAM和NF-κB基因表達的影響。抵抗素處理后的3.0 h內，各基因水平無明顯變化；處理6.0 h后，各基因表達水平均極顯著上調(P<0.01)，且各基因表達量峰值均出現在12.0 h；之后的24.0 h雖略有下降，但仍表現為極顯著上調(圖1)。

表1qRT-PCR基因擴增各種引物

Table1Primers for amplification of genes by qRT-PCR

基因Gene序列Sequence登陸號GenBank IDTLR4F: CCTAGCAAGAGCAGAGAACCAGAAGNM-174198.6R: GTCACTGGTGGCTTCTTCTTCACAGTRAMF: CCTAGCAAGAGCAGAGAACCAGAAGU19578.1R: GTCACTGGTGGCTTCTTCTTCACAGNF-KBF: GAGATCATCGAGCAGCCCAAXM-002695167.5R: ATAGTGGGGTGGGTCTTGGTβ-actinF: GCCCATCTATGAGGGGTACGAF 191490.1R: TCACGGACGATTTCCGCT

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同。* showed significant difference at P<0.05， ** showed extremely significant difference at P<0.01.The same as below.圖1 抵抗素誘導時間對牛肺泡巨噬細胞TLR4、TRAM和NF-κB基因表達的影響Fig.1 Effects of different resistin induction time on TLR4， TRAM， NF-κB gene expression of bovine alveolar macrophages

2.2 抵抗素誘導牛肺泡巨噬細胞后促炎細胞因子表達差異

細胞上清中1L-1β、IL-6、TNF-α等促炎細胞因子的ELISA檢測結果見圖2。抵抗素誘導1.5 h后，1L-1β、IL-6、TNF-α等促炎細胞因子表達量均極顯著上調(P<0.01)，且1.5～12.0 h內各促炎細胞因子的表達存在時間依賴效應。

圖2 抵抗素誘導時間對牛肺泡巨噬細胞培養液上清中IL-1β、IL-6、TNF-α表達的影響Fig.2 Effects of different resistin induction time on IL-1β、IL-6、TNF-αexpression of bovine alveolar macrophages

3 討論

巨噬細胞分布于機體的各個組織，在天然免疫系統中起著重要作用。肺泡巨噬細胞是呼吸道抵抗病原感染的第一道防線。目前發現肺組織中存在支氣管巨噬細胞、間質巨噬細胞和肺泡巨噬細胞等3種巨噬細胞，在健康狀況下，肺泡巨噬細胞占肺部巨噬細胞90%以上[11]。當肺部受到感染時，肺泡巨噬細胞發揮強烈促炎作用，釋放大量炎癥介質[12]，建立肺部炎癥環境[13]。

抵抗素具有促炎作用，在多種炎性疾病中均發揮重要的調控作用。抵抗素參與炎癥的調控機制目前仍不明確，且存在較大爭議，Tarkowski[9]利用人單核白血病細胞(THP-1)，發現抵抗素與TLR4發生作用，并通過MyD88依賴途徑激活NF-κB，最終加重炎癥反應程度。

TLRs是介導天然免疫的重要跨膜傳遞受體，可識別多種病原體，并迅速激活機體免疫應答。TLR4是一種與炎癥及免疫性疾病密切相關的常見模式識別受體，發現最早，且唯一既能激活MyD88依賴信號通路，又能激活MyD88非依賴信號通路的受體。在TLR4/MyD88非依賴途徑中，TRIF通過誘導下游激酶活化促使信號傳導，是該通路重要的接頭蛋白。TRIF的缺失會導致NF-κB的損傷[14]，而TRIF的激活必須通過Toll受體相關分子(toll-like receptors associated molecule，TRAM)。TRAM是一個重要的接頭分子，連接TLR4和TRIF，活化后的TRIF通過一系列信號傳導激活NF-κB，最終導致大量促炎細胞因子表達釋放，造成炎性損傷。

NF-κB是一類廣泛存在于機體各類細胞中的轉錄因子，與炎癥反應、免疫應答等密切相關。多種經典的炎性相關疾病，如動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎、炎性腸道疾病和心肌再灌注損傷中，均發現NF-κB的過度表達[15-16]。目前發現NF-κB存在經典與非經典2條信號通路，經典通路可由T細胞受體、Toll受體激活，非經典通路可由CD40、B細胞激活因子等刺激物活化，進而促進炎性細胞因子轉錄增加，加重炎癥反應[17]。大量研究表明，NF-κB可誘導IL-6、1L-1β、TNF-α等細胞因子及某些炎性級聯放大相關的酶大量持續表達，最后造成并加重炎癥反應[18]。

本研究使用牛抵抗素體外處理牛肺泡巨噬細胞，發現誘導6.0 h后TLR4、TRAM、NF-κB基因mRNA水平出現極顯著上調(P<0.01)，12.0 h時達到峰值；誘導1.5 h后，IL-6、1L-1β、TNF-α等促炎細胞因子表達量極顯著升高(P<0.01)，且在一定時間范圍內，呈現時間依賴效應。抵抗素可作用于牛肺泡巨噬細胞，通過Toll4/MyD88非依賴途徑，激活NF-κB，上調IL-6、1L-1β、TNF-α等促炎細胞因子，加重肺部炎癥反應程度。本研究結果中，IL-6、1L-1β、TNF-α等促炎細胞因子表達量的增加時間早于TLR4、TRAM、NF-κB等基因mRNA上調時間，因此抵抗素能否通過其他信號通路調控牛肺部炎癥，仍需深入研究，以期為牛肺部炎癥疾病的治療及預防提供新的思路和策略。