魚(yú)類(lèi)C-型凝集素結(jié)構(gòu)特征及其免疫功能

王 莉，張 杰，趙賢亮，狄桂蘭，孔祥會(huì)

( 1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007 )

1 魚(yú)類(lèi)C-型凝集素

C-型凝集素是最早被發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物凝集素之一。C-型凝集素家族成員膠固素在牛血清中最先被發(fā)現(xiàn)[26]。起初認(rèn)為C-型凝集素是一類(lèi)依賴(lài)Ca2+的糖結(jié)合蛋白。隨著研究的深入，不同結(jié)構(gòu)和功能的C-型凝集素被逐漸確定，發(fā)現(xiàn)并不是所有的C-型凝集素均依賴(lài)Ca2+。魚(yú)類(lèi)有些C-型凝集素發(fā)揮功能，并不依賴(lài)Ca2+ [13]。C-型凝集素的重要特征是具有糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域，且在糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域中存在高度保守的基序。晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，C-型凝集素的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域具有特殊的球狀結(jié)構(gòu)，而其他已知的蛋白中不存在該類(lèi)型的結(jié)構(gòu)域。因此，糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域的存在是判定其為C-型凝集素的標(biāo)準(zhǔn)[27-28]。目前一般認(rèn)為，魚(yú)類(lèi)C-型凝集素是一類(lèi)至少含有一個(gè)糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域的蛋白超家族。即使有些C-型凝集素并不能結(jié)合糖，但只要含有與糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域相似結(jié)構(gòu)域的蛋白，均可稱(chēng)為C-型凝集素[29]。

2 魚(yú)類(lèi)C-型凝集素亞家族

Drickamer等[30]根據(jù)脊椎動(dòng)物C-型凝集素的進(jìn)化、結(jié)構(gòu)及功能的相關(guān)性將其分為7個(gè)亞家族(Ⅰ～Ⅶ)。隨著研究逐步深入，至2002年增加至14個(gè)亞家族(Ⅷ～ⅩⅣ)[31]。Zelensky等[32]基于紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)基因組相關(guān)研究又發(fā)現(xiàn)3個(gè)亞家族(ⅩⅤ～ⅩⅦ)。因此，脊椎動(dòng)物C-型凝集素依據(jù)其結(jié)構(gòu)域元件組成不同，可分為17個(gè)亞家族。Zelensky等[32]通過(guò)對(duì)紅鰭東方鲀進(jìn)行基因組測(cè)序及分析比對(duì)，發(fā)現(xiàn)紅鰭東方鲀中含有與脊椎動(dòng)物C-型凝集素相對(duì)應(yīng)的15個(gè)亞家族，每個(gè)亞家族擁有與脊椎動(dòng)物相同的成員，但未發(fā)現(xiàn)與脊椎動(dòng)物C-型凝集素Ⅴ和Ⅶ亞家族相對(duì)應(yīng)的成員。進(jìn)一步通過(guò)序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)紅鰭東方鲀C-型凝集素中的某些亞家族的成員，如硫酸軟骨蛋白多糖家族成員，與脊椎動(dòng)物相比高度保守。

3 魚(yú)類(lèi)C-型凝集素的蛋白結(jié)構(gòu)特征

脊椎動(dòng)物C-型凝集素蛋白晶體結(jié)構(gòu)表明，糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域由110～130個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，具有獨(dú)特的緊密球形結(jié)構(gòu)[29]。該結(jié)構(gòu)域含有雙環(huán)結(jié)構(gòu)(圖1)，整體是1個(gè)由N-端和C-端2個(gè)β折疊(β1和β5)構(gòu)成的反向平行的β-片層；第2個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)被稱(chēng)為“長(zhǎng)環(huán)”區(qū)域，位于整個(gè)結(jié)構(gòu)域的內(nèi)部，延伸到核心區(qū)，是糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域與Ca2+和糖類(lèi)結(jié)合相關(guān)的部位。2個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的基部由4個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基(C1、C2、C3和C4)形成的二硫鍵連接，其中C1和C4連接整體環(huán)狀結(jié)構(gòu)的β5和α1，C2和C3連接“長(zhǎng)環(huán)”區(qū)域的β3和β5。其余肽段則形成兩個(gè)側(cè)翼的α螺旋結(jié)構(gòu)(α1和α2)及第2個(gè)反向平行的β-片層(β2、β3和β4)[27]。采用SWISS-MODLE軟件預(yù)測(cè)松江鱸C-型凝集素的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)松江鱸C-型凝集素的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域?yàn)殡p環(huán)結(jié)構(gòu)的緊密球形結(jié)構(gòu)(圖2)。雙環(huán)結(jié)構(gòu)的基部由4個(gè)半胱氨酸殘基(C1、C2、C3和C4)形成的二硫鍵連接；“長(zhǎng)環(huán)”區(qū)域?yàn)樘亲R(shí)別結(jié)構(gòu)域與Ca2+和糖類(lèi)結(jié)合相關(guān)的部位。預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)與脊椎動(dòng)物C-型凝集素的蛋白晶體結(jié)構(gòu)極其相似[16](圖2)。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，許多魚(yú)類(lèi)C-型凝集素的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域中均存在4個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，形成的二硫鍵對(duì)于構(gòu)建和穩(wěn)固C-型凝集素的雙環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)揮重要作用[22,33]。

部分C-型凝集素的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域在多肽鏈N-端含有1個(gè)功能未知的β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由1對(duì)半胱氨酸殘基(C0和C0′)形成的二硫鍵固定。據(jù)此將糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域分為兩類(lèi)：含有該β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)及半胱氨酸殘基(C0和C0′)的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域被稱(chēng)作“長(zhǎng)型”糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域，而不含這對(duì)半胱氨酸殘基的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域被稱(chēng)為“短型”糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域[27,34-35]。“長(zhǎng)型”糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域在斜帶石斑魚(yú)、松江鱸、香魚(yú)(Plecoglossusaltivelis)及大黃魚(yú)C-型凝集素中均有報(bào)道[11,16,18,22]。

圖1 C-型凝集素的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域三級(jí)結(jié)構(gòu)[29]藍(lán)色為“長(zhǎng)環(huán)”區(qū)域，橙色棒狀結(jié)構(gòu)為半胱氨酸形成的二硫鍵.“長(zhǎng)型”糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域的β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)(β1′)和二硫鍵(C0和C0′)均有顯示.

圖2 松江鱸C-型凝集素糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)[16]

4 C-型凝集素糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)和關(guān)鍵基序與糖結(jié)合的特異性

X射線晶體學(xué)和位點(diǎn)突變等方法為研究糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域與糖結(jié)合機(jī)制提供了很大幫助，對(duì)多個(gè)C-型凝集素結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域含有4個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)[29,38-39]。其中Ca2+結(jié)合位點(diǎn)2是C-型凝集素結(jié)合糖的重要部位。C-型凝集素對(duì)糖的識(shí)別活性和結(jié)合特異性主要取決于Ca2+結(jié)合位點(diǎn)2的質(zhì)子供體和質(zhì)子受體的位置。與Ca2+結(jié)合的氨基酸殘基通過(guò)側(cè)鏈的羰基與Ca2+和糖形成復(fù)合體，這些氨基酸殘基構(gòu)成了兩組關(guān)鍵的氨基酸基序[29]。

以大鼠甘露糖結(jié)合蛋白A為例，第一組關(guān)鍵的氨基酸基序是谷氨酸—脯氨酸—天冬酰胺(EPN)。該基序位于“長(zhǎng)環(huán)”結(jié)構(gòu)區(qū)域，谷氨酸和天冬酰胺被脯氨酸分離并分布于同側(cè)。谷氨酸和天冬酰胺通過(guò)與位于D-甘露糖赤道軸的3-OH和4-OH結(jié)合形成氫鍵，同時(shí)與Ca2+形成兩個(gè)配位鍵[27]。在該位點(diǎn)上，還可存在另一種關(guān)鍵的氨基酸基序是谷氨酰胺—脯氨酸—天冬氨酸(QPD)，谷氨酰胺和天冬氨酸通過(guò)與D-半乳糖徑向軸的3-OH和赤道軸的4-OH結(jié)合形成氫鍵，同樣也能與Ca2+形成兩個(gè)配位鍵。蛋白晶體結(jié)構(gòu)學(xué)的研究表明，關(guān)鍵的氨基酸基序EPN或QPD并沒(méi)有使Ca2+結(jié)合位點(diǎn)2的結(jié)構(gòu)發(fā)生重大變化，變化的關(guān)鍵在于交換了與糖配體結(jié)合平面上的質(zhì)子供體和質(zhì)子受體的位置，進(jìn)而將氫鍵的結(jié)合從非對(duì)稱(chēng)的甘露糖轉(zhuǎn)換成了對(duì)稱(chēng)的半乳糖[40]。對(duì)多種C-型凝集素突變體結(jié)合特異性的研究表明，僅將C-型凝集素中關(guān)鍵的氨基酸基序EPN突變?yōu)镼PD，就可改變凝集素的糖結(jié)合特異性[41]。

第二組關(guān)鍵的氨基酸基序是位于β4的色氨酸—天冬酰胺—天冬氨酸(WND)，其中天冬酰胺和天冬氨酸能與Ca2+相互作用，同時(shí)也能與糖的羥基形成氫鍵。而且色氨酸是一個(gè)非常保守的氨基酸殘基，有助于疏水中心的形成。

5 魚(yú)類(lèi)C-型凝集素的免疫功能

C-型凝集素家族為一類(lèi)重要的模式識(shí)別受體，通過(guò)識(shí)別微生物表面的糖類(lèi)結(jié)構(gòu)，引發(fā)凝集微生物、誘導(dǎo)吞噬、激活補(bǔ)體等過(guò)程[42-43]，并隨著特異性免疫的出現(xiàn)而參與調(diào)節(jié)特異性免疫[44]。目前關(guān)于魚(yú)類(lèi)C-型凝集素免疫功能的研究進(jìn)展及相關(guān)物種見(jiàn)表1。

5.1 C-型凝集素對(duì)病原相關(guān)分子模式的識(shí)別與結(jié)合

魚(yú)類(lèi)C-型凝集素通過(guò)其糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域識(shí)別與結(jié)合微生物表面的脂多糖、肽聚糖、甘露糖及葡聚糖等糖類(lèi)結(jié)構(gòu)的病原相關(guān)分子模式。通過(guò)糖類(lèi)抑制C-型凝集素對(duì)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集來(lái)間接反映C-型凝集素可結(jié)合的糖類(lèi)；也可通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)直接檢測(cè)C-型凝集素與糖類(lèi)結(jié)構(gòu)的結(jié)合能力。

2016年，自許氏平鲉中獲得一種僅含一個(gè)糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域的C-型凝集素，可凝集魚(yú)類(lèi)病原菌腸道弧菌(Vibrioichthyoenteri)和創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)。但在甘露糖存在的情況下，會(huì)抑制其對(duì)致病菌的凝集能力。因此，推測(cè)該凝集素可能是通過(guò)識(shí)別與結(jié)合甘露糖來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)腸道弧菌和創(chuàng)傷弧菌的結(jié)合與凝集[23]。同年，大黃魚(yú)中發(fā)現(xiàn)1種C-型凝集素蛋白，可廣泛凝集革蘭氏陰性菌，包括大腸桿菌(Escherichiacoli)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)及溶藻弧菌(V.alginolyticus)。但在脂多糖存在的條件下，其凝集能力會(huì)減弱甚至消失。因此，推測(cè)此凝集素是通過(guò)識(shí)別革蘭氏陰性菌表面的脂多糖進(jìn)而凝集致病菌，從而抑制致病菌對(duì)魚(yú)體的侵染[22]。

本課題組自淇河鯽魚(yú)中克隆獲得1種C-型凝集素，構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體獲得其重組蛋白。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)表明，該C-型凝集素的重組蛋白可與脂多糖及肽聚糖發(fā)生識(shí)別及結(jié)合作用，且對(duì)脂多糖的結(jié)合能力強(qiáng)于肽聚糖[33]。

5.2 C-型凝集素與紅細(xì)胞或致病微生物的凝集作用

能夠凝集紅細(xì)胞是C-型凝集素的基本特征。多種魚(yú)類(lèi)的C-型凝集素能凝集人、家兔及魚(yú)類(lèi)的紅細(xì)胞。有些C-型凝集素依賴(lài)Ca2+，才能發(fā)揮凝集紅細(xì)胞的能力，有些則不需要。例如，從納氏海蟾魚(yú)(Thalassophrynenattereri)體內(nèi)分離到1種C-型凝集素，具有不依賴(lài)Ca2+凝集人紅細(xì)胞的能力[13]。而斜帶石斑魚(yú)C-型凝集素的重組蛋白必須在Ca2+存在的條件下才能凝集家兔紅細(xì)胞[11]；大黃魚(yú)中獲得1種僅含單個(gè)糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域的C-型凝集素，在Ca2+存在的條件下，其重組蛋白能凝集人、家兔和大黃魚(yú)的紅細(xì)胞，對(duì)人和大黃魚(yú)的紅細(xì)胞凝集活性較強(qiáng)[22]。

除了可以凝集紅細(xì)胞，魚(yú)類(lèi)C-型凝集素對(duì)大量的致病微生物，包括革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌及真菌均能產(chǎn)生凝集作用。松江鱸C-型凝集素的重組表達(dá)蛋白在Ca2+存在條件下，既可以凝集革蘭氏陰性菌大腸桿菌、鰻弧菌(V.anguillarum)、綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)及肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)；還可以凝集革蘭氏陽(yáng)性菌枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensi)和真菌釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[16]。大黃魚(yú)的C-型凝集素重組蛋白在Ca2+存在條件下，可凝集所有的受試微生物包括4種革蘭氏陰性菌和3種革蘭氏陽(yáng)性菌[22]。2015年，自半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)中克隆得到1個(gè)單糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域的C-型凝集素。該凝集素可凝集鰻弧菌和藤黃微球菌(Micrococcusluteus)。其糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域中的保守基序EPN若發(fā)生突變，就會(huì)失去凝集鰻弧菌和藤黃微球菌的能力[17]。因此，推測(cè)該凝集素保守基序在凝集致病菌中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。綜上所述，魚(yú)類(lèi)C-型凝集素通過(guò)對(duì)致病菌的識(shí)別與凝集，可以在一定程度上減弱致病菌對(duì)魚(yú)體的侵襲與感染，也可以引發(fā)下游的免疫效應(yīng)，如增強(qiáng)免疫細(xì)胞的吞噬能力，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，清除體內(nèi)病原菌等。

5.3 C-型凝集素可增強(qiáng)免疫細(xì)胞的吞噬能力

魚(yú)類(lèi)C-型凝集素可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力，激活中性粒細(xì)胞，刺激淋巴細(xì)胞的增殖，參與免疫調(diào)節(jié)。大菱鲆C-型凝集素可以刺激腎臟淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的殺傷力[9]。斑馬魚(yú)甘露糖結(jié)合凝集素(1種C-型凝集素)能夠促進(jìn)鯉巨噬細(xì)胞對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的吞噬作用[45]。利用離子交換層析法，Lopesferreira等[13]從納氏海蟾魚(yú)體內(nèi)分離到1個(gè)分子量?jī)H為15 ku的C-型凝集素。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該凝集素可以激活小鼠(Musmusculus)的中性粒細(xì)胞，具有免疫調(diào)節(jié)功效。

在香魚(yú)的頭腎和外周血中鑒定獲得1個(gè)跨膜的C-型凝集素受體，其可與白細(xì)胞衍生趨化因子2發(fā)生相互作用，推測(cè)該C-型凝集素受體可能通過(guò)與白細(xì)胞衍生趨化因子2的結(jié)合作用，影響中性粒細(xì)胞趨化作用而介導(dǎo)細(xì)胞免疫[18]。將白細(xì)胞衍生趨化因子2的重組蛋白加入香魚(yú)的單核及巨噬細(xì)胞，結(jié)果單核及巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平包括白介素-1β、白介素-10、腫瘤壞死因子-α及粒細(xì)胞集落刺激因子均顯著增加；增強(qiáng)了單核及巨噬細(xì)胞對(duì)大腸桿菌的吞噬能力和殺傷能力。但是，若加入白細(xì)胞衍生趨化因子2重組蛋白的同時(shí)再加入抗香魚(yú)C-型凝集素受體的抗體(封閉C-型凝集素受體的胞外區(qū))，上述的單核及巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平以及對(duì)大腸桿菌的吞噬能力和殺傷能力顯著降低。說(shuō)明香魚(yú)的這種C-型凝集素受體介導(dǎo)了白細(xì)胞衍生趨化因子2對(duì)香魚(yú)的單核及巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)控作用[19]。

自許氏平鲉中鑒定得到的1種C-型凝集素可提高頭腎中巨噬細(xì)胞對(duì)創(chuàng)傷弧菌的吞噬能力。在體試驗(yàn)證明，感染創(chuàng)傷弧菌的許氏平鲉經(jīng)過(guò)該凝集素重組蛋白處理，與對(duì)照組(未經(jīng)該凝集素重組蛋白處理)相比，腎臟中創(chuàng)傷弧菌的數(shù)量明顯減少。說(shuō)明許氏平鲉C-型凝集素具備明顯的免疫調(diào)節(jié)機(jī)能，在宿主防御致病菌入侵過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[23]。

5.4 激活補(bǔ)體途徑

甘露糖結(jié)合凝集素作為C-型凝集素家族的一名特殊成員[46-47]，通過(guò)自身的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域與微生物表面的糖基結(jié)合，活化甘露糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶，進(jìn)而激活補(bǔ)體系統(tǒng)[48-55]。

綜上所述，甘露糖結(jié)合凝集素相關(guān)研究主要集中于基因克隆、組織表達(dá)、致病菌感染后的免疫響應(yīng)及影響致病菌凝集和吞噬等方面。然而關(guān)于甘露糖結(jié)合凝集素與甘露糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶是否可以結(jié)合，結(jié)合后如何激活補(bǔ)體系統(tǒng)啟動(dòng)先天免疫，仍需進(jìn)一步深入研究。

表1 魚(yú)類(lèi)C-型凝集素的免疫功能

6 展 望

目前，魚(yú)類(lèi)C-型凝集素相關(guān)的研究主要集中于其對(duì)病原相關(guān)分子模式的識(shí)別與結(jié)合，引發(fā)致病菌凝集，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)致病菌的吞噬能力等方面。研究表明，病原菌感染魚(yú)體后，魚(yú)類(lèi)C-型凝集素可發(fā)揮重要的免疫作用。今后應(yīng)深入研究C-型凝集素增強(qiáng)魚(yú)體免疫和防病的分子機(jī)制，探明C-型凝集素參與魚(yú)體免疫和防病的機(jī)理，開(kāi)發(fā)新型漁用抗菌劑，以有效防控魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性疾病的發(fā)生。