堿脅迫下羅非魚鰓氨轉運蛋白Rh基因的表達

涂翰卿，趙金良，黃思穎，郝月月，程亞美，曹曉穎

( 上海海洋大學，農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室，水產動物遺傳育種中心上海市協同創新中心，水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306 )

氨是魚類蛋白質代謝的最終產物之一，主要在肝臟內通過氨基酸的轉氨和脫氨作用產生[1]。鰓是魚類對外進行氣體、物質交換的重要場所，還是維持體內酸堿平衡及排氨的重要器官。以往認為，氨(NH3的形式)排泄主要是經由鰓上皮細胞以被動外擴散方式排出去[2]，最新研究顯示，鰓組織中存在一類恒河猴血型相關糖蛋白(Rh蛋白)專職氨轉運，能以主動轉運的方式排氨，與細菌和植物氨轉運載體蛋白(AMT)、酵母甲氨透明質酸酶(MEP)具有較高同源性[3-4]。Rh蛋白具有3種異構體：Rhag、Rhbg、Rhcg[5]。魚類中最早在紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)鰓組織中鑒定出Rhag、Rhbg、Rhcg1和Rhcg2 4種不同亞型，使用基因敲除技術證明其均參與了氨轉運過程[6-7]。在高氨環境下，虹鱒(Oncorhynchusmykiss)鰓組織中Rhbg、Rhcg1、Rhcg2基因表達量顯著上調[8]。Rh蛋白在魚體內的分布具有特異性，如Rhag位于紅細胞上，Rhbg幾乎存在所有組織中，而Rhcg則主要分布在鰓、腎和皮膚等排氨器官中[3]。鯉魚(Cyprinuscarpio)鰓組織中Rhag、Rhbg、Rhcg1基因表達水平極顯著高于其他組織[9]。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗魚來源于上海海洋大學羅非魚種質資源試驗站，平均體質量約50 g，試驗前將尼羅羅非魚于室內0.6 m×0.5 m×0.4 m淡水水族箱內暫養14 d，期間正常投喂、排污、換水。正式試驗前3 d停食，排空腸道糞便，并挑選具有良好體征、活力強的個體進行堿脅迫試驗。堿度通過在淡水中添加NaHCO3調節，配置好后曝氣1 d備用。使用便攜式HI83200多參數水質分析儀測量水體堿度并以此作出修正。

參照文獻[18]分別設置2、4、6 g/L NaHCO3的急性脅迫組和初始堿度為2 g/L NaHCO3并每日提高1 g/L的慢性脅迫組，脅迫共進行120 h。此時慢性脅迫組正好是到達6 g/L后24 h，同時設置1個空白對照組。每個試驗組放置20尾試驗魚，設置3個重復。試驗期持續充氧，保證溶解氧>3 g/L。

急性脅迫組分別于脅迫0、2、4、6、12、24、48、72、96、120 h時自每個試驗組隨機選取3尾魚，慢性脅迫組于脅迫24、48、72、96、120 h時自每個試驗組隨機取3尾魚。使用注射器自魚尾端靜脈抽血，4 ℃靜置12 h后3000 r/min，4 ℃，離心10 min取上層血清保存在-20 ℃冰箱。對魚進行活體解剖，取出鰓組織分成兩部分，一部分置于-80 ℃冰箱內保存，另一部分立刻用于免疫組化。

血氨測定試劑盒(南京建成生物公司)，RT-PCR相關試劑盒(TaKaRa公司)。Rhag一抗為兔單克隆抗體、Rhbg一抗為鼠單克隆抗體(Abcam公司)，Rhcg一抗為鼠單克隆抗體(Santa公司)。防脫玻片、SABC三步法試劑盒(武漢博士德公司和上海威奧生物科技有限公司)。RT-PCR所用特異性引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 血氨濃度測定

使用試劑盒檢測血液中氨的濃度，用Synergy H1酶標儀(Bio-tek, USA)檢測樣本吸光值，建立吸光值與標準品的相關性，換算得出血液樣品的實際氨濃度。

1.2.2 Rh基因mRNA相對表達

根據美國國立生物技術信息中心網站已經公布的尼羅羅非魚Rh家族基因Rhag(登錄號:XM_003446300.3)、Rhbg(登錄號:XM_003456422.4)、Rhcg1(登錄號:XM_003440579.3)、Rhcg2(登錄號:XM_005467111.3)的序列，通過使用Primer 5軟件對序列進行分析設計特異性引物(表1)。液氮研磨鰓，Trizol提取總RNA，用RNase free ddH2O溶解，用OD-1000+分光光度計(Onedrop，國產)檢測RNA含量和A260/A280值，ABS值為1.8～2.1的樣本保留。以總RNA為模板作反轉錄合成cDNA。按照SYBR Premix ExTaq說明書進行RT-PCR擴增。反應程序為：95 ℃ 預變性30 s；95 ℃ 變性5 s，58～62 ℃ 退火延伸30 s，40個循環；95 ℃ 熔解10 s，65 ℃ 退火5 s。根據試驗結果調整擴增程序，提高擴增效率。采用2-ΔΔCt法換算不同基因的相對表達量。

表1 引物信息

1.2.3 免疫組化

急性與慢性脅迫120 h時間點的鰓組織經生理鹽水漂洗后，放入4%多聚甲醛中固定12～16 h，用1×PBS溶液沖洗3次，逐級經過30%～100%梯度酒精脫水，再經二甲苯透明(鰓組織處理2～3 min)，石蠟包埋制作蠟塊切片(5 μm)，脫蠟復水。敷上0.3%的過氧化氫甲醇溶液10 min以滅活內源性酶，1×PBS溶液沖洗3次，10%山羊血清封閉30 min，血清甩干不沖洗。敷上稀釋到合適含量的一抗，4 ℃孵育過夜(通常12 h)，再1×PBS漂洗3次。敷上相應二抗室溫孵育30 min，1×PBS漂洗3次。敷上辣根過氧化物酶標記的高靈敏度鏈霉親和素，室溫30 min，水洗后使用DAB試劑盒顯色5 min，蘇木精復染10 s后自來水沖洗，再經梯度酒精脫水、二甲苯透明各10 min，最后滴加中性樹膠封片。其中陰性對照組不敷一抗，其他步驟均相同。不同堿度下的每種Rh蛋白隨機選取5個40倍視野采集成像。

1.2.4 數據分析

試驗數據使用SPSS 22統計軟件分析，統計試驗樣本的平均值和標準差，通過單因素方差分析檢測顯著性，Duncan多重比較檢測差異性，以P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同堿脅迫下尼羅羅非魚血氨濃度的變化

堿脅迫開始后，空白對照組(0 g/L)尼羅羅非魚血氨較長時間后出現波動但總體變化不顯著。急性脅迫組(2、4、6 g/L)血氨在0～12 h內快速升高達到峰值，12 h之后出現回落并維持在高于空白對照組的水平，呈現隨堿度的升高而升高的趨勢。

慢性脅迫組血氨在24～120 h內均高于空白對照組的水平，呈波動狀態(圖1)。

圖1 不同堿脅迫對尼羅羅非魚血氨濃度的影響

2.2 堿脅迫對尼羅羅非魚鰓組織中Rh基因表達量影響

2.2.1 Rhag mRNA的相對表達量變化

急性脅迫組中，尼羅羅非魚鰓組織中的Rhag基因的相對表達量隨時間的變化在12 h開始出現顯著上升(P<0.05)，并于24 h達峰值。慢性脅迫組在24～120 h內，Rhag基因表達量均維持在較高水平(圖2)。

圖2 堿脅迫對尼羅羅非魚鰓Rhag基因相對表達量的影響

2.2.2 Rhbg mRNA的相對表達量變化

急性脅迫組中，鰓組織中的Rhbg基因的相對表達量隨時間的變化在6 h出現顯著上升(P<0.05)，在24 h達峰值，隨后開始下降。慢性脅迫組Rhbg基因則在 48 h達峰值后開始顯著下降(P<0.05)(圖3)。

2.2.3 Rhcg1 mRNA的相對表達量變化

急性脅迫組中，鰓組織中的Rhcg1基因的相對表達量隨時間的變化在4 h出現顯著上升(P<0.05)，在24 h達峰值后開始顯著下降(P<0.05)。慢性脅迫組在48 h達峰值后開始顯著下降(P<0.05)(圖4)。

2.2.4 Rhcg2 mRNA的相對表達量變化

急性脅迫組中，鰓組織中的Rhcg2基因的相對表達量隨時間的變化在4 h出現顯著上升(P<0.05)，并在24 h達峰值后開始顯著下降(P<0.05)。慢性脅迫組于24 h達峰值后開始顯著下降(P<0.05)(圖5)。

2.2.5 急性脅迫24 h 4種Rh基因的相對表達量

比較4種Rh基因各堿度組24 h的相對表達量可知，在鰓組織中Rhcg1基因的相對表達量顯著高于Rhag、Rhbg、Rhcg2基因(P<0.05)(圖6)。

圖3 堿脅迫對尼羅羅非魚鰓Rhbg基因相對表達量的影響

圖4 堿脅迫對尼羅羅非魚鰓Rhcg1基因相對表達量的影響

圖5 堿脅迫對尼羅羅非魚鰓Rhcg2基因相對表達量的影響

圖6 堿脅迫24 h尼羅羅非魚鰓組織中Rhag、Rhbg、Rhcg1、Rhcg2基因的相對表達量

2.3 免疫組化

免疫組化的結果顯示，急性脅迫組中，在鰓組織中分別檢測到Rhag、Rhbg和Rhcg免疫陽性反應，且表現出隨堿度的升高陽性反應增強的現象，陰性對照組中未發現陽性反應；慢性脅迫組中也在鰓組織中檢測到3種Rh蛋白的陽性反應。Rhag免疫陽性細胞主要分布在鰓小片上，Rhbg和Rhcg免疫陽性細胞主要分布在鰓小片的基部(圖7)。

圖7 不同堿度下尼羅羅非魚鰓組織Rh蛋白免疫組化(40×)

3 討 論

3.1 不同堿度脅迫對血氨濃度變化的影響

氨是魚體內代謝的重要終產物，大部分魚類的含氮廢物是以NH3的形式排泄[20]。堿脅迫開始后，受外部堿環境的影響，氨的被動擴散受到抑制，魚體內的NH3開始累積。NH3具有較強的毒性，當NH3含量過高會導致魚類死亡[21]。本研究中，急性堿脅迫條件下，尼羅羅非魚血氨濃度快速上升，于12 h到達峰值，并呈現隨堿度升高而升高的趨勢，之后逐漸回落并維持在高于空白對照的水平。證明尼羅羅非魚能通過自身調節適應6 g/L以下堿度環境[18]。

慢性脅迫組在0～24 h所處條件與2 g/L急性脅迫組相同。24 h之后，隨著堿度的不斷升高，受到新的堿度脅迫，慢性脅迫組血氨濃度均明顯高于空白對照水平，并呈現一定的波動。相較于6 g/L急性脅迫，慢性脅迫對血氨濃度的影響持續時間長，但是影響程度輕。這表明慢性脅迫條件下，尼羅羅非魚能夠更好地適應堿環境的變化[22-23]。

3.2 堿脅迫下Rh基因在鰓組織中的表達特征

前期研究表明，為緩解體內高濃度NH3的毒害作用，尼羅羅非魚可能存在兩種氨代謝途徑：一種是尿素代謝，另一種是谷氨酰胺代謝[18]。其中谷氨酰胺途徑是主要的氨代謝途徑，此種途徑最終會在鰓組織中將谷氨酰胺還原成氨排出體外。研究表明，魚類Rhag、Rhbg、Rhcg1和Rhcg2具有NH3轉運能力，并直接參與鰓組織的主動排NH3[24]。本試驗中，急性脅迫組血氨濃度升高在12 h到達峰值后開始回落，同時Rhag、Rhbg、Rhcg1和Rhcg2基因在鰓組織中的表達顯著上調，并于24 h到達峰值，并隨著血氨開始逐漸下降并趨于穩定水平時，Rh基因的表達量也開始出現下調，表明Rh蛋白參與血氨調節；慢性脅迫組由于堿脅迫持續加強，血氨濃度在24～120 h繼續波動，相應的Rh基因的表達量也依然維持在較高水平，進一步表明，Rh蛋白確實參與了血氨調節過程。根據在急性堿度脅迫24 h時Rhag、Rhbg、Rhcg1和Rhcg2基因之間的相對表達水平，Rhcg1基因的相對表達量顯著高于其他3種基因(P<0.05)，推測Rhcg1是尼羅羅非魚鰓組織中重要的氨轉運基因，與Mak等[25-26]研究結果一致。

3.3 堿脅迫下Rh蛋白在鰓組織中的表達特征

Rh蛋白基因在魚類的鰓、肝、腎等組織中均有表達[9,18]。免疫組化結果表明，急性脅迫組中Rhag、Rhbg和Rhcg在鰓組織中均發現免疫陽性反應，且隨著堿度的升高，陽性反應有增強的現象；慢性脅迫組中也發現陽性反應，但陽性反應要弱于6 g/L堿度組。其中Rhag是一種紅細胞相關蛋白，主要存在紅細胞上，免疫組化結果顯示，Rhag的陽性反應在鰓小片上，這是因為鰓小片上密布毛細血管，Rhag陽性反應可能與鰓小片內大量紅細胞的聚集有關。Rhbg和Rhcg的陽性反應均位于鰓小片基部的扁平上皮細胞上，與紅鰭東方鲀中發現Rhbg位于鰓扁平上皮細胞的基底側質膜上、Rhcg2位于頂部質膜[27]，及斑馬魚(Daniorerio)Rhcg1位于鰓上V型H+-ATPase富含線粒體細胞頂膜[6]等結果較為類似。結果表明，尼羅羅非魚NH3轉運過程主要通過鰓小片基部的上皮細胞進行。

本研究表明，在堿脅迫環境下，體內氨的被動擴散受到抑制，引發血氨水平上升，尼羅羅非魚能夠通過加強鰓組織中Rh糖蛋白的主動轉運氨來參與血氨平衡過程，Rhcg蛋白可能是主要轉運蛋白。