斑節對蝦性腺組織、細胞的原代培養條件優化

朱丹丹，江世貴，黃建華，周發林，楊其彬，姜 松，楊麗詩

( 1.中國水產科學研究院 南海水產研究所，農業農村部南海漁業資源開發利用重點試驗室，廣東 廣州 510300； 2.上海海洋大學 水產與生命學院，上海 201306； 3.中國水產科學研究院 南海水產研究所 深圳試驗基地，廣東 深圳 518108 )

斑節對蝦(Penaeusmonodon)，屬節肢動物門、甲殼動物亞門、十足目、枝鰓亞目、對蝦科、對蝦屬，是對蝦屬中的最大型種。斑節對蝦的人工繁育過程一直以人工授精為主，但此方法會受到多種外界因素的影響，導致受精成功率及受精卵質量下降，因此目前針對斑節對蝦性腺成熟規律的研究已成為人工繁育技術創新的重要突破口。

盡管對甲殼動物的性腺成熟過程的研究已較多[1-4]，并且在人類、果蠅等模式生物成熟細胞系的水平上也進行了較為深入的研究[5-6]，但因為對蝦成熟細胞系的缺失，諸多結論無法在對蝦的細胞水平上進行驗證，因此如果能建立起斑節對蝦的性腺組織成熟細胞系，將有助于對斑節對蝦性腺成熟調控機制的探索和驗證。

迄今為止，有不少國內外專家學者對對蝦組織細胞體外培養進行了研究和探索，如Chen等[7]首次進行了斑節對蝦卵巢組織的原代培養，并且成功傳至3代；胡珂等[8]對中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)肝胰腺組織進行離體培養，傳代至28代；Luedeman等[9]使用了10種培養基配方對藍對蝦(Penaeusstylirostris)和凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的卵巢組織進行了培養；Hsu等[10]利用堿性成纖維細胞生長因子等使淋巴器官的細胞傳至90代，并建立了有限細胞系；王立平等[11]將中國明對蝦甲殼下上皮組織細胞傳代至25代。經分析發現，即便是針對同一種對蝦，報道的培養條件也不同，無法確定體外組織細胞存活所需的最適條件，原代培養的成功率也較低，永生性的細胞株一直未能建立，但已有一些利用培養出的離體組織進行相關機制研究的報道，如李國鵬[12]證實，MAPK信號通路在原代培養斑馬魚(Daniorerio)卵母細胞的成熟過程中起到了關鍵作用；Jose等[13]以原代培養的斑節對蝦淋巴組織為基礎，探究了白斑綜合征病毒與細胞的作用關系及相關免疫基因的表達情況；韓萍等[14]利用斑節對蝦卵巢組織的離體培養初步探究了多種促性腺激素釋放激素對卵母細胞的影響。筆者在前人研究的基礎上，為更進一步了解不同培養方法和不同培養基配方對斑節對蝦離體組織和細胞的生長、形態、活力及基因表達的影響，通過比較在3種改良培養基和2種處理方法(酶解法和機械分離法)下的細胞生長情況、活力變化規律以及原代培養狀態下MAPK信號通路相關基因的表達變化情況，對培養過程中細胞和基因的變化規律進行探索，以期對斑節對蝦性腺組織和細胞的原代培養過程進行初步優化，從而通過提高性腺細胞存活率，建立成熟高效的原代組織及細胞培養體系，為建立斑節對蝦原代細胞研究平臺提供支持數據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

斑節對蝦取自中國水產科學研究院南海水產研究所深圳試驗基地，充氧運回廣州實驗室，雌蝦3尾，體質量30～50 g，雄蝦2尾，體質量20～30 g，體色正常、健康有活力，用充分曝氣的自來水和海水晶配制人工海水，鹽度15，水溫(20±3) ℃，連續充氣暫養1 d[15]。

1.2 組織培養材料

1.2.1 培養基

取1包Leibovitz′s L-15培養基粉末(Invitrogen)，加入500 mL電阻率為18.2 MΩ·cm超純水(Millipore公司)，配置成2×L-15培養基母液，經0.45 μm濾膜過濾后高壓滅菌備用。

以2×L-15培養基為基礎培養基，通過添加15%胎牛血清(Invitrogen)及相應無機鹽溶液配置出3種試驗培養基，調節pH為7.2，具體培養基配方見表1。

1.2.2 其他培養用溶液

100×PSN(三抗，Gibco)，胎牛血清(Gibco)，0.25%胰蛋白酶(Trypsin-EDTA，Gibco)；配制7.5 g/L NaCl，5 g/L NaCl，1 g/L 葡萄糖，0.32 g/L KCl，1.02 g/L MgCl2，0.49 g/L MgSO4，2 g/L CaCl2溶液，均使用18.2 MΩ·cm的超純水配置，充分溶解后經0.45 μm濾膜過濾，高壓滅菌備用。

表1 培養基配方

1.3 試驗方法

將斑節對蝦先用0.1%高錳酸鉀溶液充氧浸泡20 min，再用70%乙醇對體表進行2次消毒，最后用含1% PSN的Dulbecco磷酸鹽緩沖液(Gibco)沖洗2～3次。取出卵巢(側葉部分)及精巢組織，將性腺組織在75%乙醇中快速漂洗1次，然后轉移至無菌Dulbecco磷酸鹽緩沖液中漂洗至少2次，用眼科剪剪碎成約1 mm3的組織小塊，根據以下處理方法分為2組：

(1)機械分離組：用巴斯德吸管進行機械吹打, 使組織塊分散成游離細胞團，之后均勻接種在加入不同完全培養基的96孔板中。

(2)酶解組：使用0.1%胰蛋白酶(由含有1%PSN的Dulbecco磷酸鹽緩沖液稀釋)在室溫黑暗的環境下消化組織塊10～20 min后終止酶解反應，經過80孔目的細胞篩多次過濾后加入完全培養液，吹打均勻后接種在加入不同完全培養基的96孔板中。

每個處理分別設置3個試驗組，每個試驗組均設置3個平行。之后將培養板置于28 ℃恒溫培養箱中，過夜培養后觀察并更換培養基，之后每2 d更換50%培養液。

1.4 試驗樣品采集與處理

每隔24 h觀察、記錄細胞生長情況。分別在接種24、72、120 h后取出部分樣品進行蘇木精—伊紅染色切片的制作、細胞活力的檢測以及基因表達定量試驗cDNA模板的制作。

(1)蘇木精—伊紅染色切片制備：將取出的部分卵巢或精巢組織小塊置于波恩氏固定液中固定過夜，經流水沖洗及70%～100%梯度酒精脫水后，使用1∶1乙醇二甲苯透明，經過浸蠟包埋后過夜放置，進行連續切片，切片厚4 μm，取其中一張切片進行蘇木精—伊紅染色。

(2)細胞活力檢測：按照全式金公司的TransDetect? Cell Counting Kit 說明書，用培養液配成單個細胞懸液，用血球計數板進行細胞計數，在96孔板中接種100 μL細胞懸液，每孔細胞數量在2×103個，置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，之后每孔加CCK溶液10 μL，孵育4 h后終止培養。5000 r/min離心5 min，吸取孔內培養上清液。使用酶標儀測量450 nm處的吸光值并記錄結果。

(3)基因表達定量：按照Megan公司HiPure Total RNA Plus Kits試劑盒(No.R4122)提取斑節對蝦性腺細胞培養各時間點樣品的總RNA，提取的總RNA經瓊脂糖凝膠電泳確定其完整度，經分光光度計測定含量及純度。使用上海寶生物公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉錄試劑盒(No.RR047)將1 μg RNA逆轉錄為熒光定量PCR的模板。在Roche Lightcycler 480熒光定量PCR儀(Roche，USA)中進行熒光定量PCR反應。反應程序設計為：95 ℃預變性40 s；95 ℃變性 5 s，60 ℃退火20 s，共進行40個循環。每個組分別設置3個重復。擴增EF-1α作為內參，其他基因的定量引物設計見表2。

1.5 數據處理

試驗數據采用相對ΔCt法 (2-ΔΔCt法)計算各組樣品中的相對表達量，顯著性檢驗利用SPSS 19.0軟件進行，采用單因素方差分析和多重比較分析數據，P<0.05為差異顯著。

表2 試驗中所用引物序列

2 結果及分析

2.1 受試樣品發育分期確定

參照文獻[14,18-19]的方法對斑節對蝦性腺分期情況進行判定。所解剖的斑節對蝦卵巢組織呈嫩黃色，組織切片顯示，卵巢內含有大量處于核染色質期或核仁周期的卵原細胞和初級卵母細胞致密排列(圖1)，符合卵黃發生前期的形態特征，判定本試驗用雌蝦卵巢處于Ⅱ期。同時所解剖的斑節對蝦精巢組織呈白色，組織切片可見4種類型的細胞(圖2)，精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞較致密排列，據此判定本試驗用雄蝦精巢處于成熟期。

圖1 卵巢Ⅱ期切片a～c依次為放大10倍，200倍及400倍; Oo.卵原細胞，Po.初級卵母細胞.

圖2 精巢切片a～c依次為放大10倍，200倍及400倍；SG.精原細胞，PSC.初級精原細胞，SSC.次級精原細胞，ST.精子細胞.

2.2 不同培養基中的細胞形態觀察及切片觀察

2.2.1 酶解法樣品的細胞形態觀察

酶解后使用80目篩網進行過濾，除單個游離的卵巢細胞外，仍有部分細胞團懸浮。接種1 d后即可見細胞團的周圍有大量細胞游離(圖3a)，2～3 d后可見部分細胞出現分裂相，隨著細胞培養的繼續，到第5 d時，部分組織塊開始松散，出現細胞破裂、數量減少，1號和2號培養基的情況相對較好。

精巢組織酶解后可見大量分散的細胞，2～3 d后細胞數量增多，細胞團減小，細胞出現貼壁生長的現象(圖3b)，部分精原細胞開始發生形態變化，細胞種類增多，到第5 d，細胞呈貼壁生長，但部分細胞出現破裂現象，其中1號和2號培養基中的細胞形態較為完整。

2.2.2 采用機械分離法處理的細胞形態觀察

機械分離接種后24、72、120 h取組織塊樣品進行蘇木精—伊紅染色切片觀察(圖4)。0 h時可見卵原細胞致密排列，24 h時各組的細胞變化不大，出現少量的分裂相卵母細胞。72 h后各組出現較大變化，2號培養基少量細胞出現染色質固縮，1號培養基處理組有部分細胞出現染色質固縮的形態，卵母細胞排列開始變松散，3號培養基細胞破裂和凋亡較嚴重，卵母細胞減少，120 h時1、2號培養基染色質固縮的程度有一定加深，細胞加劇分散，但仍可見正常的卵母細胞，而3號培養基幾乎看不到正常的卵母細胞，視野中為大量的亮藍色濃集細胞核，細胞核碎片狀，邊集。直至第7 d時，2號培養基中培養的組織中仍有少數活細胞。

精巢的蘇木精—伊紅染色切片中可以看到，1號培養基和2號培養基中的組織在試驗第5 d時仍然保持一定形態及細胞完整度，但3號培養基的組織形態完全消散(圖5)。

圖3 酶解法處理后的斑節對蝦性腺細胞a.雌蝦卵巢細胞，b.雄蝦精巢細胞.

圖4 雌蝦卵巢組織蘇木精—伊紅染色切片a.1號培養基，b.2號培養基，c.3號培養基.下同.

圖5 雄蝦精巢組織蘇木精—伊紅染色切片

2.3 不同培養條件下中的細胞活力的變化

酶解法和機械分離法進行原代培養對卵母細胞和精原細胞活力的影響見圖6。1號培養基細胞活力普遍高于另外2種培養基，其中3號培養基的細胞活力相對較低。在1號培養基處理下，酶解法和機械分離法對精原細胞活力影響不大，均在離體培養24 h時達到頂峰，72 h以后逐漸下降，而酶解法培養的卵母細胞活力均高于機械分離法，并在72 h后仍然具有較高活力；2號培養基條件下，酶解法和機械分離法對精原細胞活力影響相似，而酶解法的卵母細胞活力高于機械分離法，各組別在培養后0～72 h逐漸上升，在120 h后維持平衡；3號培養基條件下，酶解法的細胞活力顯著高于機械分離法，0～72 h細胞活力逐漸升高，至72 h時達到最大值，隨后下降，而機械分離法不能提高精原細胞的活力，更降低了卵母細胞活力。

2.4 不同培養條件下的MAPK信號通路相關基因的表達量變化

在原代細胞培養過程中，MAPK信號通路相關基因的表達均不同(圖7)。雌蝦中c-Mos基因表達量最高，分別比Ras、ERK、MEK1的表達量高約27倍、10倍、11倍，雄蝦中也是如此，分別比Ras、ERK、MEK1的表達量高約17倍、21倍、25倍。

圖6 雌雄蝦在不同培養基中的細胞活力變化情況

圖7 不同培養基中的雌、雄蝦的MAPK信號通路相關基因表達量的變化情況

1號培養基中，雌蝦的Ras基因的表達量在72 h時顯著上調，120 h時顯著下降，2、3號培養基中，72 h時顯著上調，但低于1號培養條件下的表達量，隨后在120 h時下降，但高于1號培養條件下該時間點的表達量；ERK基因的表達量在1號培養基中是逐漸上調的，在2號培養基中變化不大，在3號培養基中72 h時表達量最高，隨后下調，且同時間點里3種培養基的表達量均差異顯著(P<0.05)；MEK1基因的表達量在1號和2號培養基中無顯著變化，但在3號培養基中顯著降低；c-Mos基因的表達量在不同培養基中表達變化趨勢相似，即72 h時有所上調，120 h達到表達高峰，但1號、2號培養基中c-Mos基因的上調表達變化高于3號培養基中的表達量。

雄蝦中的Ras基因在1號培養基中72 h時上調至最高，隨后下降，而在2號和3號培養基中在72 h時下調至最低，隨后略有上升，但均未達顯著水平；ERK基因的表達量在1號培養基培養72 h后下降，120 h時顯著下降，2號、3號培養基中也在72、120 h下降，但未達顯著水平；MEK1基因在1號培養基培養72 h時上升，隨后下降，在2、3號培養基培養72 h時下降，隨后維持低水平或上升，但均未達顯著水平。c-Mos基因在3種培養基中均是72 h下調后120 h顯著上調，同時上調幅度依次為1號培養基>2號培養基>3號培養基。

3 討 論

在過去的幾十年中，很多研究團體和個人致力于建立持續的蝦細胞系，但均未獲得成功。斑節對蝦的原代細胞培養已經在鰓[7]、淋巴組織[9]、卵巢[14]、心臟[16]、肝胰腺[17]等多種組織器官上進行了探索，獲得了關于培養方法、培養基配方等方面的結論。本試驗分別在機械分離法和酶解法條件下，采用3種改良型培養基培養斑節對蝦性腺組織及細胞，以便探索不同培養方法和不同培養基下培養的組織、細胞的狀態、活力及相關基因表達的變化。

3.1 不同培養方法下細胞的生長情況

目前動物組織細胞培養主要采用機械分離法和消化法。機械分離法是取所需組織用剪刀或手術刀剪切成 1 mm3的碎塊，再經培養基或平衡鹽溶液清洗后分散植入培養瓶，均勻接種于CO2培養箱中培養或密閉培養的過程[20]。如Chen等[7]使用機械分離的方法進行了斑節對蝦淋巴器官原代細胞培養試驗，而韓萍等[14]用組織培養法觀察了促性腺激素釋放激素對離體卵巢發育的影響。本試驗結果發現，機械分離法可以成功進行體外精原和卵母細胞的培養，但在不同培養條件下差異較大。其中在1號培養基中，即僅有L-15培養基的情況下，機械分離的精原細胞活力較強，與酶解的差別不大，但3號培養基條件下對精原細胞的活力幾乎沒有影響。消化法是使用胰蛋白酶(含EDTA)、膠原酶或透明質酸酶對組織和細胞進行消化解離。其中，胰蛋白酶的作用是使細胞間的基質蛋白水解從而使細胞離散，但不同的組織或者細胞對胰蛋白酶的作用反應不一樣。劉凱于等[16-17]的斑節對蝦試驗結果表明，胰蛋白酶的消化使肝胰腺、血淋巴等細胞無法在體外正常存活，或對這些細胞的結構產生較大損傷。使用胰蛋白酶處理日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)淋巴組織細胞，即使在低含量、低溫度、短作用時間下淋巴組織細胞也依然無法存活[21]。這說明對蝦細胞對于胰蛋白酶的作用是高度敏感的。但張巖等[22]使用胰蛋白酶酶解的方法成功觀察到了紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)XO-SG的單個神經細胞，這可能是因為神經中含有大量結締組織，不易被胰蛋白酶酶解。

本試驗利用胰蛋白酶分別酶解卵巢和精巢組織后發現，酶解后培養的精原細胞活力在3種不同培養基條件下均近于或高于機械分離方法。卵巢和精巢均具有少量結締組織，被胰蛋白酶消化后使得原代性腺細胞團發生分散。

本研究結果表明，酶解法亦適用于對蝦細胞培養，在特定培養條件下，比機械分離法效果更好。因此，酶解法與機械分離法應該根據具體試驗進行選擇，機械分離法易于操作，可以適用于對組織的影響變化試驗，而酶解法適用于觀察單個細胞的形態變化、蛋白定位等試驗。

3.2 不同培養基中細胞的生長情況

目前對蝦細胞培養主要還是采用改良的哺乳動物或昆蟲細胞培養基，如MEM、RPMI、L-15、M199、Grace液等。其中L-15及M199已證明能很好地支持對蝦細胞的生長。如Chen等[7]發現，L-15作為基本培養基培養的斑節對蝦卵巢原代細胞可以進行3次傳代，2×L-15培養基較1×L-15培養基的培養情況更為理想。韓萍等[14]也利用L-15作為基礎培養基成功培養了離體斑節對蝦卵巢組織。

本試驗1號培養基直接使用2×L-15作為基本培養基，通過顯微觀察和切片觀察發現，其對保持斑節對蝦卵母細胞和精原細胞的形態維持和生長均具有促進作用。2號培養基添加了葡萄糖作為碳源，并添加一定含量的Na+來調控滲透壓，對細胞生長有良好促進作用，細胞活力在0～72 h得到提高，并在120 h時仍保持較高的細胞活力水平，這提示，滲透壓對原代培養的性腺細胞的生長和增殖具有重要意義。3號培養基在2號培養基的基礎上又添加了K+、Mg2+、Ca2+離子，卻對細胞生長無顯著促進作用，相反，對細胞活力有一定的抑制作用。這與之前的報道相似，因此推測，由于斑節對蝦屬廣鹽性海洋甲殼類動物，長期適應環境中劇烈的滲透壓變化，具有較強的離子調節功能，但離體培養時，培養基的滲透壓通過簡單地添加無機鹽難以調節至蝦體自身的滲透壓，于是可能抑制了組織或細胞的生長，但有研究顯示，若添加對蝦自身的組織提取液或淋巴液及各類生長因子可以優化對蝦細胞的生長情況，但對細胞生長、分裂均無明顯的幫助[23-24]。

本試驗的細胞培養結果顯示，卵巢的組織團塊和分散細胞在培養的5 d里，隨著培養時間的增加，各培養基中的組織都開始出現破碎、變形的情況，但是2號培養基中相較于1、3號培養基，組織發生變化的速度較慢，直至第7 d時，組織中仍有少數活細胞(圖4)。精巢的組織團塊接種時就可見大量分散細胞分布在培養板上，2～3 d后細胞數量增多，組織塊減小，細胞出現貼壁生長的現象，部分精原細胞開始發生形態變化，細胞種類增多，至第5 d時，1號培養基和2號培養基中的組織仍然保持一定形態及細胞完整度，但3號培養基的組織完全失去活性。離體培養過程中，雖然培養時間短，但有些細胞依然能分裂和生長。這是由于原代培養的細胞中包含的細胞種類較多，大部分細胞因具有不同的生長潛力而出現細胞死亡，只剩下少數細胞(主要是成纖維樣細胞)能夠存活且具備分裂的能力，之后隨著培養時間的延長，細胞活力下降，可能引起了細胞的凋亡。

3.3 細胞活力的變化情況

原代培養試驗的細胞活力比值結果顯示，酶解后的細胞與機械分離后的細胞相比具有更高活力，卵巢及精巢的細胞活力比值相差較大。在電子耦合試劑1-Methoxy PMS存在的情況下，CCK試劑中的水溶性四唑鹽可以被活細胞線粒體內的脫氫酶還原成橙黃色甲臜，而死細胞則無此功能，甲臜量與活細胞數量呈正比，因此細胞活力的上升或下降可能由細胞增殖或死亡等引起。離體培養過程中雖然培養時間短，但隨著細胞培養的進行，細胞不僅發生著分裂增殖，也發生著凋亡死亡，兩種過程同時發生，因此細胞的活力比值會出現波動，但當細胞生長穩定后，細胞活力比值就會趨于動態平衡。而原代培養細胞一般會包含多種細胞，大部分細胞會因為生長潛力不同而出現細胞死亡，只剩下少數細胞(主要是成纖維樣細胞)能夠存活且具備分裂的能力[25]。隨著培養時間的延長，細胞無法形成完整的能量供給，可能引起細胞的死亡，導致活力下降。對蝦卵巢Ⅱ期細胞種類較多，細胞發育時期不統一，中央卵管內的卵圓細胞增殖減弱，卵黃發生前期卵母細胞處于發育中，并逐漸充滿卵室，而精巢已處于成熟期，細胞形態及種類較為穩定，本試驗的結果也顯示，在培養前期細胞種類雜亂，細胞活力比值低，而后期，由于細胞種類減少，細胞生長環境穩定，細胞開始正常生長增殖，細胞活力比值穩定或升高。

3.4 MAPK信號通路的變化情況

機體發育和細胞生長與MAPK信號通路密切相關，其中的ERK信號通路被證明參與生物體的多種生理病理過程，如參與性腺的生長發育、細胞再生及細胞分化[26-27]。促有絲分裂刺激因子(如生長因子、細胞因子)激活了位于細胞膜上的酪氨酸激酶受體、G蛋白偶聯受體等相關受體后，通過小GTP蛋白家族Ras蛋白或相關蛋白的介導激活Raf激酶家族成員，并依次磷酸化MEK1/2和ERK1和ERK2。c-Mos參與了磷酸化MEK1/2的過程。

通過檢測MAPK信號通路關鍵因子，結果發現卵母細胞的MAPK信號通路被激活，由于ERK-MEK1存在相互作用，其變化趨勢差別不顯著，而MAPK信號通路上游基因c-Mos激活效果顯著，隨著培養時間增加，c-Mos上調水平顯著。同時在1號、2號培養基中c-Mos的上調水平高于3號培養基處理下的水平。提示c-Mos是與細胞生長呈正相關的基因，可以考慮作為指示細胞培養情況的基因。Mos蛋白是存在于生殖細胞中的絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，在卵母細胞生長發育過程中積累，因此該蛋白在卵母細胞第二次減數分裂中扮演著重要角色，尤其在遇到促性腺發育因子刺激后會被大量合成，激活卵母細胞，使其進入MⅡ期，之后又開始發生降解消化。本試驗中，c-Mos基因在細胞培養過程中的7～17 h，表達量降低至起始的18%～43%，這也印證了MⅠ期到MⅡ期的轉化[28]。在豬卵母細胞中的c-Mos基因表達量在卵母細胞被激活后也會迅速降低，卵母細胞的成熟也受到了刺激[29]。培養72 h時，培養的性腺細胞可能正在經歷MⅠ期到MⅡ期的轉化，卵母細胞被激活過程。而c-Mos原癌基因在小鼠附睪的區域特異性表達及定位也提示，c-Mos基因可能在精子成熟過程中發揮調節功能[30]。因此，本試驗檢測的不同培養基中的多種MAPK信號通路重要因子的時空分布結果證實了MAPK信號通路與細胞的增殖死亡過程相關。

總之，本試驗以L-15培養基為基礎，通過3種不同培養基配方考察了酶解法和機械分離法對斑節對蝦的性腺細胞的離體培養效果。通過觀察細胞及蘇木精—伊紅染色的組織切片，測定3種培養基下的細胞活力值，發現酶解法同樣適用于斑節對蝦性腺細胞離體培養，1、2號培養基在一定培養條件下優于3號培養基。