患病草魚腸道病原菌的分離鑒定及毒力研究

鄒 升，龔 亮，李東杰，曹麗娜，李艷平，何昊城，丁學(xué)知，易敢峰,2，夏立秋

( 1.湖南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，微生物分子生物學(xué) 湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410081； 2.大北農(nóng)水產(chǎn)科技集團(tuán)，福建 詔安 363500 )

洞庭湖是中國(guó)第二大淡水湖，為我國(guó)淡水漁業(yè)發(fā)源地之一[1]，其淡水水產(chǎn)品在全國(guó)占有較大比重和重要地位，逐漸成為我國(guó)魚類養(yǎng)殖的主要產(chǎn)區(qū)和高產(chǎn)區(qū)[2]。按品種劃分，洞庭湖淡水養(yǎng)殖中所占比重較高的是草魚(Ctenopharynodonidellus)、鯽魚(Carassiusauratus)、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙魚(Aristichthysnobilis)和鯉魚(Cyprinuscarpio)[3]。

近年來(lái)，隨著精養(yǎng)密度的加大，飼料投喂量增加及漁藥使用頻繁，導(dǎo)致水質(zhì)惡化，養(yǎng)殖病害頻發(fā)。其中細(xì)菌性疾病是主要病害，嚴(yán)重制約和危害了淡水養(yǎng)殖業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展[4]。目前，在環(huán)洞庭湖區(qū)普遍流行的細(xì)菌性疾病有出血病、爛鰓病、腸炎病、赤皮病，這些病對(duì)各養(yǎng)殖品種都造成了較大的危害，其中以草魚、鯉魚、鰱魚和鳙魚的死亡率最高[5]。

2017年4—6月，在環(huán)洞庭湖區(qū)的安鄉(xiāng)、南縣、華容、湘陰和望城等地精養(yǎng)魚池暴發(fā)了較大范圍的草魚疾病，出現(xiàn)草魚大面積的死亡現(xiàn)象。發(fā)病草魚均表現(xiàn)為游動(dòng)緩慢、反應(yīng)遲鈍，食欲減退、部分魚體出現(xiàn)脫鱗，該病持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，短期內(nèi)可導(dǎo)致草魚大量死亡。

筆者對(duì)湖南環(huán)洞庭湖區(qū)上述地區(qū)漁場(chǎng)患病瀕臨死亡草魚的腸道進(jìn)行了病原菌分離、鑒定，并針對(duì)病原菌的生物學(xué)特性、致病性、藥物敏感性及毒力因子攜帶情況等進(jìn)行研究，旨在探索誘發(fā)該暴發(fā)病的主要病原及其生物學(xué)特性，為魚類健康養(yǎng)殖及病害防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017年4—6月，從環(huán)洞庭湖區(qū)的安鄉(xiāng)、南縣、華容、湘陰和望城等地精養(yǎng)魚池采集患病瀕臨死亡的草魚55尾。發(fā)病癥狀表現(xiàn)為體表鱗片有脫落，胸鰭鰭條基部有出血癥狀，肛門紅腫，鰓絲灰白，剖檢可見體內(nèi)血液稠黑，肝胰臟發(fā)黃。取具有典型癥狀且發(fā)病癥狀明顯的患病草魚，用75%酒精擦拭魚體表，于無(wú)菌操作臺(tái)中進(jìn)行解剖，取病變明顯的腸道組織及其內(nèi)容物，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加2%的瓊脂粉。

1.3 主要試劑及儀器

細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒、引物合成(上海生工生物試劑有限公司)?？股厮幟艏埰?上海易佰聚經(jīng)貿(mào)有限公司)；pMD-18 T載體、TaKaRa ExTaqDNA酶、Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ、DL-2000Marker、DL-5000Marker[寶生物工程(大連)有限公司]。脫纖維綿羊血血平板、培養(yǎng)基試劑(長(zhǎng)沙天恒生物技術(shù)科技有限公司)。冷場(chǎng)電子掃描顯微鏡(Hitachi Su8010)(日立公司)，凝膠成像儀(美國(guó)Kodak公司)，PCR 擴(kuò)增儀(德國(guó)Eppendorf公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.4 病原菌的分離

將腸道組織樣本及其內(nèi)容物加入無(wú)菌水研磨搗碎，吸取上清稀釋液涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)24 h后挑取優(yōu)勢(shì)單菌落再次劃線純化，純化的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中于30 ℃搖床培養(yǎng)24 h，之后保種于25%無(wú)菌甘油中，-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 菌株的形態(tài)觀察

分離得到的優(yōu)勢(shì)菌株分別接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，置于30 ℃ 培養(yǎng)24 h ，取菌體涂片，革蘭氏染色后用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)和染色特征，同時(shí)用冷場(chǎng)電子束掃描電鏡觀察菌株細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征。

1.6 菌株鑒定及分類

1.6.1 16S rRNA基因與gyrB管家基因的擴(kuò)增與測(cè)序

菌株于30 ℃振蕩搖床培養(yǎng)12 h，利用細(xì)菌基因組提取試劑盒(生工公司)提取細(xì)菌基因組，利用16S rRNA基因通用引物(引物序列為，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)和gyrB管家基因通用引物(UP1：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′，UP2R：AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACR TCNGCRTCNGTCAT)擴(kuò)增菌株對(duì)應(yīng)的基因序列[6]，序列預(yù)期長(zhǎng)度分別約為1500 bp和1200 bp。 PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2 μL Ex Taq Buffer(10×)，1.6 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L)，上游引物0.6 μL(10 μmol/L)、下游引物 0.6 μL(10 μmol/L)，模板 1 μL，0.2 μL TaKaRa Ex Taq(5 U/μL)，14 μL H2O。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃，45 s，55 ℃，45 s，72 ℃，1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。

16S rRNA基因和gyrB管家基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收?；厥债a(chǎn)物用pMD-18T vector進(jìn)行連接，之后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行氨芐抗性篩選，挑取單克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切鑒定后送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.6.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

用BLAST將菌株的16S rRNA基因和gyrB管家基因測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的序列進(jìn)行比對(duì)，運(yùn)用Mega 6.06，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(重復(fù)數(shù)為1000，步長(zhǎng)值取百分比)。

1.7 回歸感染試驗(yàn)

病原菌分別活化和擴(kuò)大培養(yǎng)后，離心收集菌體，用0.85%無(wú)菌生理鹽水將其分別稀釋制備成1×108、5.0×108cfu/mL的菌懸液。將試驗(yàn)用的健康草魚隨機(jī)分成試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10尾[體質(zhì)量為(37.2±11.0) g]。試驗(yàn)組菌液注射劑量為0.2 mL/尾，對(duì)照組注射生理鹽水0.2 mL/尾。回歸感染試驗(yàn)開始前暫養(yǎng)草魚停食48 h。試驗(yàn)采用腹腔注射法，試驗(yàn)期間水溫20～23 ℃，連續(xù)觀察并記錄各組草魚的發(fā)病和死亡情況。并對(duì)死亡草魚及時(shí)進(jìn)行解剖和病原菌的再次分離[7]，患病試驗(yàn)魚按照1.4方法進(jìn)行細(xì)菌的再分離。

1.8 藥敏試驗(yàn)

選用分別含紅霉素、四環(huán)素、多黏菌素、利福平、萬(wàn)古霉素、氨芐西林、氯霉素、慶大霉素、壯觀霉素、卡那霉素、復(fù)方新諾明的11種抗生素藥敏紙片對(duì)病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。采用Kirby-Bauer擴(kuò)散法，將經(jīng)18 h培養(yǎng)的新鮮菌液用無(wú)菌水稀釋成1.0×108cfu/mL后的菌懸液均勻涂布于LB瓊脂平板，室溫干燥3～5 min后用鑷子將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，于30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后取出，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑。

1.9 脫脂纖維綿羊血血平板試驗(yàn)

將病原菌菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)12 h后，菌液密度稀釋到1×108cfu/mL。將脫脂纖維綿羊血血平板自4 ℃冰箱中取出，在超凈臺(tái)恢復(fù)至室溫。然后吸取10 μL菌液接種于血平板上，并以嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)作為陽(yáng)性對(duì)照，置于30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察其溶血情況并記錄[8]。

1.10 毒力基因檢測(cè)

毒力基因的引物根據(jù)GenBank收錄和參考相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[9]，設(shè)計(jì)毒力基因氣溶素、細(xì)胞毒性腸毒素、黏附素、絲氨酸蛋白酶、核酸酶和S-核糖基高半胱氨酸酶基因的引物，設(shè)計(jì)的6對(duì)引物及片段大小見表1。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃，45 s，55 ℃，45 s，72 ℃，1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。

表1 PCR擴(kuò)增所用的引物及片段大小

2 結(jié) 果

2.1 4種病原菌的形態(tài)特征

自環(huán)洞庭湖區(qū)5個(gè)縣區(qū)的漁場(chǎng)患暴發(fā)病瀕臨死亡的草魚腸道中分離獲得4株優(yōu)勢(shì)菌株，分別為AsB002、AaB007、PSB008和LgB010，其中菌株AsB002為革蘭氏陰性菌，菌落形態(tài)呈圓形，米黃色，光滑濕潤(rùn)。菌株AaB007為革蘭氏陰性菌，菌落形態(tài)呈米黃色圓形菌落，表面光滑濕潤(rùn)，中央微隆起。菌株P(guān)SB008為革蘭氏陰性菌，菌落形態(tài)呈乳白色圓形，不透明，表面濕潤(rùn)光滑，用鞭毛染色液染色后可以觀察到細(xì)長(zhǎng)的鞭毛(圖1)。菌株LgB010為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌落形態(tài)呈灰白色圓形，濕潤(rùn)、不透明。4株菌株在光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡下觀察均為桿狀(圖2、圖3)。

2.2 病原菌的鑒定及分類

以4株菌株的基因組為模板，利用16S rRNA基因通用引物和gyrB管家基因通用引物PCR擴(kuò)增菌株對(duì)應(yīng)的基因序列，片段長(zhǎng)度大小分別為1200 bp和1500 bp(圖4)，片段與pMD-18T vector連接后進(jìn)行了質(zhì)粒檢測(cè)(圖5)和酶切鑒定(圖6)，結(jié)果顯示連接成功。擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果BLAST比對(duì)分析顯示，菌株AsB002、AaB007、PSB008、LgB010分別為溫和氣單胞菌(A.sobria)、異常嗜糖氣單胞菌(A.allosaccharophila)、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)、格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)，并對(duì)4種病原菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖7～圖10)。

圖1 菌株P(guān)SB008鞭毛染色的相差顯微鏡觀察(1000×)

圖2 4株菌株形態(tài)學(xué)觀察a.4株菌株的相差顯微鏡觀察(1000×)，b.4株菌株的革蘭氏染色(1000×)，c.4株菌株平板菌落形態(tài).

圖3 4株菌株的冷場(chǎng)掃描電鏡觀察a.10000×，b.25000×.

圖4 4種病原菌PCR檢測(cè)a.4種病原菌的16S rRNA基因PCR檢測(cè)，b.4種病原菌的gyrB管家基因PCR檢測(cè). M. DL 5000 DNA Marker，1.菌株AsB002，2.菌株AaB007，3.菌株P(guān)SB008，4.菌株LgB010.下同.

圖5 4種病原菌的gyrB-T質(zhì)粒檢測(cè)

圖6 4種病原菌的gyrB-T雙酶切檢測(cè)

圖7 根據(jù)菌株AsB002 gyrB基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖8 根據(jù)菌株AaB007 gyrB基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖9 根據(jù)菌株P(guān)SB008 gyrB基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖10 根據(jù)菌株LgB010 16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 回歸感染試驗(yàn)結(jié)果

將4種病原菌分別注射到健康草魚體內(nèi)(表2)，感染48 h后，當(dāng)病原菌密度達(dá)到1.0×108cfu/mL、注射量為200 μL/尾時(shí)，草魚開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，發(fā)病癥狀與自然感染死亡的癥狀一致(圖11)，而對(duì)照組未見死亡。對(duì)感染死亡的草魚腹水及腸道中的優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行形態(tài)觀察及分子鑒定(圖12)，結(jié)果均顯示是相應(yīng)感染的病原菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4種病原菌對(duì)多種抗生素耐受性較強(qiáng)，但均對(duì)氯霉素敏感，除此之外，四環(huán)素、卡那霉素、復(fù)方新諾明能使2種以上的病原菌表現(xiàn)不同程度的敏感性(表3)。

表2 4種病原菌感染草魚的致死情況

圖11 4種病原菌株感染草魚的癥狀及對(duì)體內(nèi)病原菌株的再分離a.溫和氣單胞菌AsB002，b.異常嗜糖氣單胞菌AaB007，c.類志賀鄰單胞菌PSB008，d.格氏乳球菌LgB010.

圖12 回歸感染死亡的草魚體內(nèi)病原菌株的gyrB管家基因PCR檢測(cè)M. DL 5000 DNA Marker，a～d. 依次為自感染溫和氣單胞菌AsB002、異常嗜糖氣單胞菌AaB007、類志賀鄰單胞菌PSB008、格氏乳球菌LgB010死亡草魚體內(nèi)分離的病原菌.

抗生素溫和氣單胞菌AsB002異常嗜糖氣單胞菌AaB007類志賀鄰單胞菌PSB008格氏乳球菌LgB010抑菌圈范圍/mm紅霉素RRRIR≤12,I:13～17,S≥18四環(huán)素IRIIR≤14,I:15～18,S≥19多黏菌素RRRRR≤12,S>12利福平RRRRR≤16,I:17～19,S≥20萬(wàn)古霉素RRRSR≤13,I:13～15,S≥15氨芐西林RRRSR≤11,I:12～14,S≥15氯霉素SSSIR≤12,I:13～17,S≥18慶大霉素RRRIR≤12,I:13～14,S≥15壯觀霉素RRSRR≤14,I:15～17,S≥18卡那霉素IIRRR≤13,I:14～17,S≥18復(fù)方新諾明IISRR≤10,I:11～17,S≥16

注：“S”為高敏；“I”為中敏；“R”為耐藥.

2.5 脫脂纖維綿羊血血平板試驗(yàn)結(jié)果

在脫脂纖維綿羊血平板上，溫和氣單胞菌AsB002、異常嗜糖氣單胞菌AaB007具有溶血現(xiàn)象，與陽(yáng)性對(duì)照嗜水氣單胞菌現(xiàn)象一致，而類志賀鄰單胞菌PSB008、格氏乳球菌LgB010未發(fā)現(xiàn)溶血現(xiàn)象(圖13)。

圖13 4種病原菌溶血活性檢測(cè)；a.溫和氣單胞菌AsB002， b.異常嗜糖氣單胞菌AaB007， c.類志賀鄰單胞菌PSB008， d.格氏乳球菌LgB010， e.嗜水氣單胞菌(對(duì)照).

2.6 毒力基因檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果

PCR擴(kuò)增片段電泳檢測(cè)顯示，溫和氣單胞菌AsB002的毒力基因檢測(cè)中的1、2、4、5、6泳道條帶大小與預(yù)期的S-核糖基高半胱氨酸酶基因、核酸酶、黏附素、氣溶素、細(xì)胞毒性腸毒素片段大小一致(圖14)，異常嗜糖氣單胞菌AaB007的毒力基因檢測(cè)中的1、2、3、5、6泳道條帶大小與預(yù)期的S-核糖基高半胱氨酸酶基因、核酸酶、氣溶素、絲氨酸蛋白酶、黏附素片段大小一致(圖15)，類志賀鄰單胞菌PSB008的毒力基因檢測(cè)中的4、6泳道條帶大小與預(yù)期的S-核糖基高半胱氨酸酶基因、黏附素片段大小一致(圖16)，格氏乳球菌LgB010的毒力基因檢測(cè)中的1泳道條帶大小與預(yù)期的氣溶素片段大小一致(圖17)。

圖14 溫和氣單胞菌AsB002菌株的毒力基因檢測(cè)1.S-核糖基高半胱氨酸酶基因， 2.核酸酶基因， 3.絲氨酸蛋白酶基因， 4.黏附素基因， 5.氣溶素基因， 6.細(xì)胞毒性腸毒素基因.

圖15 異常嗜糖氣單胞菌AaB007菌株的毒力基因檢測(cè)1.S-核糖基高半胱氨酸酶基因， 2.核酸酶基因， 3.氣溶素基因， 4.細(xì)胞毒性腸毒素基因， 5.絲氨酸蛋白酶基因， 6.黏附素基因.

圖16 類志賀鄰單胞菌PSB008菌株的毒力基因檢測(cè)1.細(xì)胞毒性腸毒素基因， 2.氣溶素基因， 3.絲氨酸蛋白酶基因， 4.S-核糖基高半胱氨酸酶基因， 5.核酸酶基因， 6.黏附素基因.

圖17 格氏乳球菌LgB010菌株的毒力基因檢測(cè)1.氣溶素基因， 2.細(xì)胞毒性腸毒素基因， 3.核酸酶基因， 4.S-核糖基高半胱氨酸酶基因， 5.絲氨酸蛋白酶基因， 6.黏附素基因.

3 討 論

3.1 病原菌的分離和鑒定

草魚作為湖南環(huán)洞庭湖區(qū)精養(yǎng)魚池主養(yǎng)品種，年產(chǎn)量近5.0×105t，約占養(yǎng)殖總量的70%。但近年來(lái)草魚病害暴發(fā)加重[10]，從各養(yǎng)殖品種所占比例來(lái)看，草魚的發(fā)病面積占總發(fā)病面積的54%，而死亡數(shù)量占總發(fā)病死亡數(shù)量的50%[5]。本研究自環(huán)洞庭湖區(qū)漁場(chǎng)患暴發(fā)病瀕臨死亡草魚的腸道中分離得到4種病原菌，分別是溫和氣單胞菌AsB002、異常嗜糖氣單胞菌AaB007、類志賀鄰單胞菌PSB008、格氏乳球菌LgB010。其中，溫和氣單胞菌是危害我國(guó)淡水養(yǎng)殖業(yè)的重要病原菌之一[11]，能引起魚類、爬行類、兩棲類等冷血?jiǎng)游锏臄⊙Y[12]。該菌主要在草魚、鯽魚[13]、鯉魚[14]、大麻哈魚(Oncorhynchusketa)[15]中發(fā)病較多，也是重要的人畜共患病的病原菌，能引發(fā)腹瀉、傷口感染和敗血癥等癥狀[16]。異常嗜糖氣單胞菌[17]常見于施氏鱘(Acipenserschrenckii)[18]中，是一種條件致病菌，在條件合適時(shí)會(huì)大量繁殖，導(dǎo)致魚體發(fā)病。類志賀鄰單胞菌感染后病魚主要癥狀為魚眼球突出、鰓絲發(fā)白、體表浮腫、肌肉糜爛、肛門紅腫[19]，主要感染草魚[20]、鯽魚[21]、莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus)[22]、青魚(Mylopharyngodonpiceus)[23]等，同時(shí)也是重要的人畜共患病的病原菌[24]。格氏乳球菌可引發(fā)腸炎、肝臟貧血及腹腔出血等病癥[25]。

本研究對(duì)4種病原菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、病理學(xué)的研究。該4種病原菌在洞庭湖區(qū)范圍內(nèi)發(fā)病情況少見報(bào)道，因此為加強(qiáng)環(huán)洞庭湖區(qū)草魚精養(yǎng)魚池健康養(yǎng)殖定期出現(xiàn)的病害防治提供了科學(xué)依據(jù)。

3.2 病原菌的毒力研究

4種病原菌對(duì)多種抗生素具有耐受性，但均對(duì)氯霉素敏感，除此之外，四環(huán)素、卡那霉素、復(fù)方新諾明能使2種以上的病原菌表現(xiàn)不同程度的敏感性。氯霉素屬于廣譜性抗生素，它通過(guò)與核糖體的50S亞單位結(jié)合從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均具有較好的抑制作用[26]。但是氯霉素毒副作用較大[27]，因此規(guī)定在水產(chǎn)品中“不得檢出”[28]。這說(shuō)明，對(duì)本試驗(yàn)分離得到的4種病原菌引起的草魚病害問(wèn)題防治的關(guān)鍵是篩選和研發(fā)新的防治藥物，篩選出具有廣譜性的拮抗菌來(lái)對(duì)抗這4種病原菌可能會(huì)成為有效的防控措施。同時(shí)，高度重視對(duì)水產(chǎn)微生物制劑的研發(fā)，實(shí)施健康生態(tài)養(yǎng)殖，實(shí)現(xiàn)環(huán)洞庭湖區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展。

分別對(duì)4種病原菌進(jìn)行回歸感染，結(jié)果顯示，當(dāng)4種病原菌密度分別為5.0×108cfu/mL時(shí)，注射量為200 μL/尾時(shí)，草魚的致死率高達(dá)100%，并可自體內(nèi)分離到相應(yīng)感染的病原菌。4種病原菌對(duì)草魚的危害巨大，表明本次草魚患暴發(fā)病的病原菌主要為上述4種病原菌。

脫纖維綿羊血血平板上檢測(cè)到了溫和氣單胞菌AsB002、異常嗜糖氣單胞菌AaB007的溶血活性，可能具有溶血素基因，而類志賀鄰單胞菌PSB008、格氏乳球菌LgB010未檢測(cè)到。王海娟等[7,29]自溫和氣單胞菌中克隆擴(kuò)增出溶血素基因，構(gòu)建重組了溶血素，并檢測(cè)了活性。這說(shuō)明溶血素基因在多種不同來(lái)源的溫和氣單胞菌中存在。在許多致病菌中，溶血素均作為重要的毒力基因參與細(xì)胞的致病過(guò)程[30]，例如，霍亂弧菌(Vibriocholerae)溶血素能裂解紅細(xì)胞和其他多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞[31]。另外，對(duì)4種病原菌的毒力基因進(jìn)行了研究，毒力基因與魚的致病性有關(guān)[32]，而毒力基因具有一定的保守性，因此以維氏氣單胞菌(A.veronii)的毒力基因設(shè)計(jì)6對(duì)引物[9]，來(lái)探究4種病原菌可能攜帶的毒力基因。目前，溫和氣單胞菌、異常嗜糖氣單胞菌、類志賀鄰單胞菌、格氏乳球菌4株菌的毒力基因研究較少。本試驗(yàn)的4種病原菌可能攜帶的毒力基因有待進(jìn)一步鑒定。

目前，洞庭湖區(qū)淡水魚類病害研究還不成熟，有些疾病的病原還不能完全確定，許多治療方法的研究需要進(jìn)一步理論驗(yàn)證。加強(qiáng)病原菌及流行病學(xué)等基礎(chǔ)研究力度，為今后生態(tài)防治方法的研究，如水體調(diào)控、生物調(diào)控等措施打下基礎(chǔ)，最終實(shí)現(xiàn)淡水魚類的健康養(yǎng)殖。