JHDM1D-AS1/miR-144-3p對H2O2誘導的PC12損傷氧化應激和炎癥的影響

張金武 沈露 肖騁 魯建華 陳夢宇 陳莉

(咸寧市中心醫院(湖北科技學院附屬第一醫院)神經內科，湖北 咸寧 437099)

缺血性腦疾病屬于神經系統疾病，其發病率和死亡率都很高，治療效果較差，嚴重影響患者的生活質量及生命安全〔1〕。氧化應激、炎癥是缺血性腦損傷等疾病的重要病理生理反應，其可相互影響，進一步討論腦缺血損傷的分子機制，尋找有效的神經保護策略是臨床治療新的策略〔2，3〕。研究表明腦缺血時腦組織lncRNA表達發生了顯著改變，參與了腦缺血的病理生理學過程，可作為急性缺血性腦卒中診斷和預后生物標志物的靶點〔4，5〕。組蛋白去甲基化酶同源物1D反義1(JHDM1D-AS1)是一種長的非編碼RNA(lncRNA)，JHDM1D-AS1過表達通過調節miR-101-3p/雙特異性磷酸酶(DUSP)1軸減輕臂叢神經損傷后脊髓中神經炎癥和神經元損傷，發揮對神經的保護作用〔6〕。過氧化氫(H2O2)處理的牙周膜干細胞中JHDM1D-AS1下調，JHDM1D-AS1上調通過降低熱休克蛋白家族成員(DNAJ)C10及真核細胞起始因子(eIF)2α的磷酸化，從而保護牙周膜干細胞免受H2O2誘導的凋亡〔7〕。而JHDM1D-AS1對腦損傷的影響及機制尚不清楚。研究報道miR-144-3p過表達顯著降低了神經元的細胞活力，促進了細胞凋亡，并增加了氧化應激；而下調miR-144-3p可以保護神經元免受氧葡萄糖剝奪和復氧誘導的神經元損傷〔8〕。腦缺血再灌注損傷中miR-144-3p被上調，lncRNA Rian過表達通過miR-144-3p/GATA結合蛋白(GATA3)信號傳導減弱了腦缺血再灌注損傷引起的細胞凋亡〔9〕。H2O2是常見的活性氧化物，可導致氧化應激反應〔10〕。本實驗用H2O2誘導PC12建立腦損傷模型，研究JHDM1D-AS1是否通過調控miR-144-3p影響PC12細胞氧化應激和炎癥反應。

1 材料與方法

1.1材料 PC12細胞(無錫欣潤生物科技有限公司)；DMEM培養基(北京凱瑞基生物科技有限公司)；H2O2溶液(上海經科化學科技有限公司)；熒光定量試劑盒(武漢科昊佳生物科技有限公司)；凋亡檢測試劑盒(日本同仁化學研究所)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)；腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(南京賽泓瑞生物科技有限公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒〔弗元(上海)生物科技有限公司〕。

1.2細胞處理與分組 PC12細胞常規培養，取對數生長期細胞，接種于96孔板，培養24 h后加入含40 μmol/L H2O2的培養液中培養，作為模型(Model)組，正常培養的細胞作為對照(Con)組；將pcDNA、pcDNA-JHDM1D-AS1、anti-miR-NC、miR-144-3p inhibitor轉染至PC12細胞后用40 μmol/L的H2O2處理，記為Model+pcDNA組、Model+pcDNA-JHDM1D-AS1組、Model+anti-miR-NC組、Model+miR-144-3p inhibitor組；將pcDNA-JHDM1D-AS1分別與miR-NC、miR-144-3p mimic共轉染至PC12細胞后用40 μmol/L的H2O2處理，記為Model+pcDNA-JHDM1D-AS1+miR-NC組、Model+pcDNA-JHDM1D-AS1+miR-144-3p mimic組。

1.3實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測JHDM1D-AS1和miR-144-3p表達水平 提取細胞總RNA，合成cDNA后按試劑盒說明進行PCR，循環條件為95℃ 3 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環；相對表達量用2-ΔΔCt法計算。JHDM1D-AS1和miR-144-3p分別以GAPDH和U6為內參，JHDM1D-AS1上游引物：5′-CCTCGCGACGCTGAGAGAATC-3′，下游：5′-ACGGCACATTCCTCCCTCGGA-3′；GAPDH上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游：5′-TCCACCCTGTTGCTGTA-3′；miR-144-3p上游引物：5′-CTCACTCACATCAACAGACATTAATT-3′，下游：5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC-3′；U6上游引物：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，下游：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，加入10 μl的膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)，再加入5 μl的碘化丙啶(PI)，混勻后避光孵育10 min；用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5試劑盒檢測細胞SOD活性和MDA含量 細胞培養48 h后，收集各組細胞，嚴格按試劑盒說明操作。

1.6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測TNF-α、IL-1β水平 各組細胞培養48 h后取上清，具體按照試劑盒操作進行檢測。

1.7雙熒光素酶報告實驗檢測JHDM1D-AS1和miR-144-3p的靶向關系 構建JHDM1D-AS1的野生型和突變型熒光素酶載體WT-JHDM1D-AS1和MUT-JHDM1D-AS1，將其分別與miR-NC和miR-144-3p共轉染至細胞PC12中，按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.8統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1JHDM1D-AS1對H2O2誘導的PC12損傷的影響 與Con組相比，Model組PC12細胞中JHDM1D-AS1表達水平明顯降低，miR-144-3p表達水平明顯升高，細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與Model組和Model+pcDNA組相比，Model+pcDNA-JHDM1D-AS1組PC12細胞中JHDM1D-AS1表達水平明顯升高，miR-144-3p表達水平明顯降低，細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，見表1，圖1。

圖1 JHDM1D-AS1對H2O2誘導的PC12凋亡的影響

2.2JHDM1D-AS1對H2O2誘導的PC12氧化應激的影響 與Con組相比，Model組PC12細胞中SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高(P<0.05)；與Model組和Model+pcDNA組相比，Model+pcDNA-JHDM1D-AS1組PC12細胞中SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低(P<0.05)，見表1。

2.3JHDM1D-AS1對H2O2誘導的PC12炎癥因子的影響 與Con組相比，Model組PC12細胞中TNF-α、IL-1β含量升高(P<0.05)；與Model組和Model+pcDNA組相比，Model+pcDNA-JHDM1D-AS1組PC12細胞中TNF-α、IL-1β含量降低(P<0.05)，見表1。

表1 JHDM1D-AS1對H2O2誘導的PC12損傷氧化應激、炎癥因子的影響

2.4JHDM1D-AS1靶向miR-144-3p JHDM1D-AS1與miR-144-3p有結合位點(圖2)；WT-JHDM1D-AS1與miR-144-3p共轉染后細胞熒光素酶活性降低(P<0.001)，MUT-JHDM1D-AS1與miR-144-3p共轉染后細胞熒光素酶活性無顯著變化，見表2。

表2 雙熒光素酶報告實驗

圖2 JHDM1D-AS1靶向miR-144-3p

2.5抑制miR-144-3p對H2O2誘導的PC12損傷氧化應激和炎癥因子的影響 與Model+anti-miR-NC組相比，Model+miR-144-3p inhibitor組細胞凋亡率明顯降低，SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，TNF-α、IL-1β含量明顯降低(均P<0.001)，見圖3，表3。

圖3 抑制miR-144-3p對H2O2誘導的PC12凋亡的影響

表3 抑制miR-144-3p對H2O2誘導的PC12損傷氧化應激和炎癥因子的影響

2.6miR-144-3p可逆轉JHDM1D-AS1對H2O2誘導的PC12損傷氧化應激和炎癥因子的影響 與Model+pcDNA-JHDM1D-AS1+miR-NC組相比，Model+pcDNA-JHDM1D-AS1+miR-144-3p mimic組細胞凋亡率明顯升高，SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，TNF-α、IL-1β含量明顯升高(均P<0.001)，見表4，圖4。

表4 miR-144-3p可逆轉JHDM1D-AS1對H2O2誘導的PC12損傷氧化應激和炎癥因子的影響

圖4 miR-144-3p可逆轉JHDM1D-AS1對H2O2誘導的PC12凋亡的影響

3 討 論

腦缺血后的神經元損傷是個復雜的病理過程，深入分析其分子機制，通過促進或抑制相關lncRNA或miRNA的表達可能對腦損傷相關疾病的治療有益〔11，12〕。研究報道JHDM1D-AS1可減輕神經炎癥，對神經損傷具有保護作用〔6〕。在營養饑餓狀態下增加的JHDM1D-AS1表達通過上調血管生成來加速胰腺癌腫瘤生長〔13〕。JHDM1D-AS1與DHX15相互作用，增強了非小細胞肺癌的生長和轉移〔14〕。而JHDM1D-AS1對H2O2誘導的PC12氧化應激和炎癥的影響還尚不清楚。本實驗結果表明過表達JHDM1D-AS1抑制了H2O2誘導的PC12細胞凋亡、氧化應激及炎癥反應。

研究報道miR-144-3p模擬物可促進促炎性細胞因子的產生，加速噬斑的形成從而導致載脂蛋白(Apo)E-/-小鼠動脈粥樣硬化的病理進展加快〔15〕。抑制miR-144-3p可增強視網膜色素上皮中依賴核因子E2相關因子(Nrf)2的抗氧化信號，并防止氧化應激引起的外部視網膜變性〔16〕。血紅素可通過上調miR-144-3p損害炎癥消退〔17〕。以上研究表明miR-144-3p參與氧化應激及炎癥反應的發生。本實驗結果表明抑制miR-144-3p表達抑制了H2O2誘導的PC12細胞凋亡、氧化應激及炎癥反應。且本實驗發現JHDM1D-AS1靶向調控miR-144-3p，而miR-144-3p過表達逆轉了JHDM1D-AS1對H2O2誘導的PC12氧化應激和炎癥因子的影響。

綜上，JHDM1D-AS1過表達可能通過下調miR-144-3p減輕H2O2誘導的PC12細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應。