四種檢驗水中糞大腸菌群標準方法的對比研究

張會強，徐錦岳,張秦銘,馬文鵬,王 斐,白 昭

(1.陜西省環境監測中心站，陜西 西安 710054; 2.大連理工大學生命與醫藥學院，遼寧 盤錦 124221)

糞大腸菌群是在44.5℃溫度下能生長并發酵乳糖產酸，產氣，需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，主要來自糞便。糞大腸菌群又稱耐熱大腸菌群，可以指示水體是否遭受糞便污染，直接指示生活污水的污染，間接反映腸道致病菌的污染風險，是水質檢驗中非常重要的衛生指標。

目前，國內測定水中糞大腸菌群的標準分析方法有多管發酵法[1]、濾膜法[1]、紙片快速法[2]和酶底物法[3]。多管發酵法早在1985年就列入了《生活飲用水標準檢驗方法》(GB 5750-85)，至今已經沿用了三十多年，是行業內公認的糞大腸菌群測定的經典方法，衛生、水利、環保等行業均有多管發酵法的方法標準。美國公共衛生協會(APHA)出版的《水和廢水標準檢驗方法》(20版)中方法9221E也采用的是多管發酵法[4]；濾膜法采用直接計數特征菌落的方式，不同于其它三種方法采用MPN法計數，其應用廣泛性僅次于多管發酵法，美國APHA方法9222D[4]和ISO9308-1:2014[5]采用的是濾膜法；紙片快速法在西方發達國家采用較少，主要在一些發展中國家使用，環保部在2015年發布了測定水中糞大腸菌群的紙片快速法[2]；酶底物法利用糞大腸菌群在鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷培養基上培養產生β-D-半乳糖苷酶，該酶可以分解色源底物釋放出黃色的鄰硝基苯酚，通過顏色變化定性，MPN法定量。我國沒有酶底物法測定糞大腸菌群的現行國家和行業標準，美國APHA方法9221 E[4]、ISO 9380-2:2012[6]和GB5750.12-2006[7]均將酶底物法列入標準，但僅限測定總大腸菌群和大腸埃希氏菌。2018年4月陜西省質量技術監督局發布了酶底物法測定糞大腸菌群的地方標準[3]，填補了酶底物法測定糞大腸菌群的標準方法空白。

現參照環保行業標準HJ/T347-2007、HJ 755-2015和DB61/T 1138-2018，對多管發酵法、濾膜法、紙片快速法和酶底物法分別從檢出限、方法操作、準確度、方法間一致性進行了對比研究。

1 儀器、試劑和耗材

GNP-9270隔水式恒溫培養箱(37℃，上海精宏實驗設備有限公司)；GHP-9160隔水式恒溫培養箱(44.5℃，上海一恒科學儀器有限公司)；LDZX-50KBS不銹鋼立式滅菌器(上海申安醫療器械廠)；Whatman MBSI微生物過濾系統(美國GE公司)；LK-2010A型程控定量封口機(西安立科環保科技有限公司)；酶底物法試劑、100mL無菌定量瓶、51孔和97孔定量檢測盤(均購自西安立科環保科技有限公司)；定量菌株Quanti-Cult Plus(美國ThermoFisher公司)；大腸菌群檢驗紙片(廣州達元綠洲生化科技有限公司)；乳糖蛋白胨、EC肉湯、MFC培養基(北京陸橋技術股份有限公司)；移液器(德國Eppendorf)；實驗用水為經121℃高壓蒸汽滅菌20min后的無菌水；槍頭等其他耗材。微生物檢測數據為偏態分布[8]，按照其統計分析要求，以下所有檢測數據均經對數(以10為底)轉換后，再進行分析計算。

2 方法對比

2.1 方法檢出限

方法檢出限取決于取樣量和最低檢出值，MPN法的檢出限為各個稀釋管為陰性時對應的MPN值。多管發酵法的接種量為300mL時，查HJ/T347-2007中表 2 可得該方法的檢出限為3MPN/L[1]；濾膜法為直接菌落計數法，當取1L水樣時方法的檢出限為0cfu/L；紙片快速法查HJ 755-2015中附錄B表可得該方法的檢出限為20MPN/L[2]；酶底物法的接種量為300mL時，查DB61/T 1138-2018中表B.1該方法的檢出限為3MPN/L[3]。

2.2 方法操作

多管發酵法需要配制乳糖蛋白胨培養基等準備工作，初發酵和復發酵試驗，檢測時間>72h；濾膜法需要配制MFC培養基等準備工作，初發酵試驗，必要時需要復發酵試驗確認，檢測時間>48h；紙片快速法直接接種商品化紙片，無須配制培養基，檢測時間>24h；酶底物法采用商品化培養基，無須配制培養基，檢測時間>24h。

2.3 標準定量菌株實驗

取Quanti-Cult Plus定量菌株R4717085(真值為66cfu/0.1mL菌液)按照說明書制備成稀釋菌液。分別用多管發酵法、濾膜法、紙片快速法和酶底物法取0.1mL菌液進行檢測，多管發酵法和紙片快速法取0.1mL菌液加入到9.9mL無菌水中，然后接種5份1.0mL、5份0.1mL、5份0.01mL，結果計算見公式(1)；濾膜法取0.1mL菌液加入到9.9mL無菌水中，旋渦振勻后進行過濾，計數陽性菌落為檢測結果；酶底物法取0.1mL菌液加入100mL無菌定量瓶中，無菌水定容后用51孔定量檢測盤檢驗，查51孔MPN表計數結果。每種方法做3個平行樣。

(1)

式中：C-0.1mL菌液中糞大腸菌群的數量，MPN/0.1mL；MPN-查15管MPN表所得的MPN值；接種量最大的一管(或紙片)體積是1.0mL，先換算成100mL中的MPN濃度，再折算成10mL稀釋菌液中濃度即0.1mL菌液的MPN值。

表1 四中方法標準定量菌株檢測數據匯總表

2.4 相關性比較

實驗選取了55個不同來源的水樣同時用多管發酵法、濾膜法、紙片快速法和酶底物法在相同的取樣量(55.5mL或5.55mL)和相同培養條件下進行檢測，將酶底物法、紙片快速法和濾膜法的檢測結果分別與經典的多管發酵法進行相關性分析(見圖1～圖3)。

圖1 多管發酵法與酶底物法測定糞大腸菌群的相關性分析

圖2 多管發酵法與紙片快速法測定糞大腸菌群的相關性分析

圖3 多管發酵法與濾膜法測定糞大腸菌群的相關性分析

采用SPSS18軟件進行配對t檢驗。多管發酵法分別與酶底物法配對t檢驗的p值為0.178；多管發酵法分別與紙片快速法配對t檢驗的p值為0.450；多管發酵法分別與濾膜法配對t檢驗的p值為0.012。

3 結果與討論

從方法的檢出限來看，濾膜法不受取樣量限制(只要水樣不堵塞濾膜)，檢出限最低；多管發酵法和酶底物法的最低檢出限同為3MPN/L；紙片快速法的檢出限為20MPN/L。

從實驗操作來看，多管發酵法和濾膜法均需要配制培養基，而且進行復發酵，操作繁瑣；紙片快速法和酶底物法無需配制培養基，操作簡單。因此，多管發酵法工作量大，耗費時間最長；濾膜法操作強度和耗費時間略低于多管發酵法；紙片快速法和酶底物法操作簡便，更適用于大量樣品的快速檢驗。

從定量菌株檢測結果來看，多管發酵法的相對誤差范圍為-7.1%～16.2%，最終值為4.5%±11.6%；紙片快速法的相對誤差范圍為-16.6%～4.3%，最終值為-6.1%±10.4%；濾膜法的相對誤差范圍為-13.2%～4.9%，最終值為-4.2%±9.0%；酶底物法的相對誤差范圍為2.1%～6.8%，最終值為4.4%±2.4%。因此，酶底物法的準確度均優于其它三種方法；酶底物法平行樣的相對標準偏差為2.6%，精密度也優于其它三種方法。

從相關性比較來看，多管發酵法分別與酶底物法配對t檢驗的p值=0.178>0.05，方法間無顯著性差異；多管發酵法分別與紙片快速法配對t檢驗的p值=0.450>0.05，方法間無顯著性差異；多管發酵法分別與濾膜法配對t檢驗的p值=0.012<0.05，存在顯著性差異。因為紙片快速法和多管發酵法均采用15管MPN法定量，而酶底物法采用51孔或97孔MPN法定量，所以紙片快速法與多管發酵法的相關性更好(0.450>0.178)。濾膜法采用直接菌落計數(cfu)，采用該方法時須與多管發酵法的數據進行可比性驗證。

4 結語

綜上所述，多管發酵法、濾膜法、紙片快速法和酶底物法在檢出限、實驗操作、準確性和精密度、檢測時間、適用范圍等(見表2)均存在差異。多管發酵法和紙片快速法已經列為《國家地表水環境質量監測網監測任務作業指導書》(試行)的指定方法。多文獻報道酶底物法適用于當前環境監測工作迫切需要[9-10]，在實際工作中應根據上述方法的特點選擇合適的分析方法。

表2 四中測定水中糞大腸菌群方法的對比匯總