酶促增香對2個品種藍莓酒理化性質及香氣物質的影響

劉方恬，李孫君，成柯，高吉慧，袁方,2*

1(華中農業大學 食品科學技術學院，湖北 武漢，430070) 2(環境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢，430070)

藍莓又名藍漿果、越橘，為杜鵑花科越橘屬，屬小漿果類，呈深藍色，近圓形，果肉細膩，甜酸適口，香氣宜人，并且富含維生素、超氧化物歧化酶、花色苷、黃酮等多種生理活性成分。藍莓具有較強的抗氧化能力，同時具有促進視紅素再合成，提高免疫力，延緩衰老及抗癌等多種生理活性功效，是國際糧農組織列出的人類五大健康食品之一，被譽為“漿果之王”[1-2]。自20世紀80年代起，我國開始從北美引進高產的藍莓品種，現近20個省份有規模栽培。其主要栽培品種有高叢、矮叢、兔眼藍莓等，分別適于鮮食和加工等不同用途。雖然起步較晚，但我國藍莓種植規模呈逐年擴大的趨勢，藍莓產業發展迅速。據不完全統計，2001年我國藍莓種植面積為25 hm2左右，2010年超過14 000 hm2，年平均增長量在150%以上[3-4]。與此同時，藍莓酒、藍莓復合果酒及藍莓果汁飲料開始悄悄興起，然而品質參差不齊，尤其在香氣品質上仍處在摸索階段。

目前，國內外研究中風味前體及其風味修飾中的關鍵酶(如β-D-葡萄糖苷酶)已有很多報道[5-7]。β-D-葡萄糖苷酶來源多樣，可以水解糖苷鍵將香氣物質從結合態變成游離態，從而達到增香的目的[7]，已被商業化生產并且廣泛應用到食品工業領域[8]。許多研究證明利用β-D-葡萄糖苷酶可不同程度地促進葡萄酒風味前體物釋放。如MARTINO等[9]利用來源于黑曲霉的經純化后的β-D-葡萄糖苷酶制劑來研究其對白葡萄酒香氣的影響，結果表明，酶處理后葡萄酒中單萜物質含量(里哪醇、α-松油醇、香茅醇、橙花醇、香葉醇)是原有含量的2倍，使葡萄酒果香更加濃郁。游離態或固定態的酶制劑能夠促進葡萄酒中揮發性物質顯著增加(約4倍)，尤其對于莫斯卡托葡萄酒，其萜醇(里哪醇、香茅醇、橙花醇、香葉醇)含量顯著增加[10]。然而，β-D-葡萄糖苷酶制劑在藍莓酒中的應用卻未見報道。從現有報道可以看出，藍莓鮮果的香氣物質主要以醇類、酯類、萜類、醛類化合物為主[11-12]。其中，萜類物質是藍莓中含量較高的揮發性物質，大約占藍莓總揮發性物質的20%～30%[13]。萜類香氣物質在果實中多以糖苷鍵合態的形式存在，由此可以推測β-D-葡萄糖苷酶制劑在藍莓酒的增香上具有一定潛力。

本文以“奧尼爾”和“密斯蒂”2個南高叢品種藍莓果為材料發酵藍莓酒，利用商業糖苷酶制劑AR2000對藍莓酒進行水解增香，并測定了酶促增香對其香氣及其他重要品質指標的影響，探討其在不同品種藍莓酒中的作用效果以及伴隨的品質變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓鮮果(南高叢品種密斯蒂和奧尼爾，產自湖北黃陂)，湖北牧童藍莓有限公司；葡萄酒活性干酵母D254、果膠酶Pectinase EX，法國Lallemand公司；Rapidase AR 2000糖苷酶制劑(簡稱AR2000)，DSM公司；白砂糖，焦亞硫酸鉀等均為市售食品級；福林酚試劑(分析純)，蘆丁(分析純)，DPPH(分析純)，上海源葉生物科技有限公司；沒食子酸(分析純)，飛揚生物化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

手持式數字折射儀(PAL-1)，日本ATAGO公司；電熱恒溫水浴鍋(HWS-12)，上海一恒科學儀器有限公司；恒溫磁力攪拌器(S22-2)，上海司樂儀器有限公司；氣相色譜儀(Agilent 6890)、質譜儀(Agilent 5973)，美國Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME萃取頭，美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 藍莓酒發酵工藝流程

1.3.2 酶解處理

加酶量實驗中，2個品種的藍莓酒各取50 mL，分別加入0、25、35 mg/L AR2000酶液于30 ℃下酶解4 h后，于-20 ℃冷凍保存。

揮發性香氣實驗中，藍莓新酒充分混勻灌裝后取100 mL于-20 ℃冷凍作為對照組，酶處理的條件為2.5 g/100 mL加酶量，30 ℃，酶解4 h。2個品種的藍莓酒各取1瓶密封置于4 ℃自然陳釀1年，作為自然陳釀組。

1.3.3 藍莓酒總花色苷、總酚和總黃酮含量測定

藍莓酒總花色苷含量參照LEE等[14]的方法，采用pH值示差法測定藍莓酒中總花色苷的含量。藍莓酒總酚含量參照李巨秀等[15]的方法，采用Folin-Ciocalteu比色法。藍莓酒總黃酮含量測定參照李世燕等[16]采用三氯化鋁比色法。

1.3.4 藍莓酒還原力和DPPH清除率測定

藍莓酒還原力的測定：將藍莓酒樣液稀釋4倍，之后取50 μL稀釋后的樣品于試管中，依次加入2.5 mL 2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.6)和質量濃度10 g/L鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合均勻后，于50 ℃條件下水浴20 min，之后快速冷卻,加入質量濃度100 g/L三氯乙酸溶液2.5 mL，混合均勻。取5 mL反應液于試管中，加5 mL蒸餾水和質量濃度1 g/L FeCl3溶液5 mL，充分混勻。以蒸餾水為參比，于700 nm波長處測定樣品吸光度。每個樣品重復測定3次。用Vc標準品在相同條件下制作標準曲線，結果以mg/L Vc計算。

藍莓酒DPPH清除率測定:將藍莓酒樣液稀釋5倍，取0.05 mL稀釋后的樣品和2.95 mL DPPH溶液(0.1 mol/L，調整吸光度至0.650左右)于試管中，混合均勻后，室溫避光靜置15 min，以體積分數為80%甲醇為對照，于517 nm波長下測定其吸光值(Ai)。空白組為取0.05 mL稀釋后的樣品和2.95 mL體積分數為80%甲醇溶液(Aj)。對照組為取0.05 mL蒸餾水和2.95 mL DPPH溶液(A0)。每個樣品重復測定3次。

(1)

式中：Ai為樣液與DPPH反應后的吸光值；Aj為樣液與80%甲醇反應后的吸光值；A0為蒸餾水與DPPH反應后的吸光值。

1.3.5 固相微萃取條件

準確量取2 mL樣品移入10 mL螺口樣品瓶中，加入8 mL飽和NaCl溶液，10 μL內標(4-辛醇，50 mg/L)，加入磁力攪拌子，用聚四氟乙烯隔墊密封，在磁力攪拌器上加熱至50 ℃，平衡15 min后，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭頂空吸附40 min，插入GC進樣口解析5 min進行GC-MS分析。每個樣品重復檢測2次。

1.3.6 GC-MS條件

色譜柱：HP-5MS (30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：40 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至160 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升至220 ℃，保持3 min；載氣(He)流速1.0 mL/min。

電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度250 ℃；質量掃描范圍m/z35～350。

1.3.7 定性、定量分析

定量分析采用外標與內標相結合的方法進行定量[17]。即通過目標化合物選擇離子峰面積與內標物選擇離子峰面積之比與這2種化合物的質量濃度之比建立標準曲線。利用所建立的標準曲線計算藍莓酒中香氣成分的含量。

1.3.8 香氣活性值(odor activity values, OAVs)

根據文獻查找每個香氣物質在10%左右乙醇溶液中的香氣閾值，根據樣品中香氣物質的含量和香氣閾值之比計算OAV。

1.3.9 數據統計

采用SPSS statistics 22對數據進行單因素方差分析(ANOVA)檢驗差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 藍莓酒基礎理化指標

2個品種藍莓果實及新酒的基礎理化指標見表1。2個品種藍莓鮮果在可溶性固形物、含水量、密度以及pH值上差異不大，但是“密斯蒂”藍莓的氨基酸態氮含量約為“奧尼爾”藍莓的2倍，并且2種藍莓果的氮含量均低于正常干型果酒發酵所需量(140～350 mg N/L)[18]，為保證發酵順利進行，在發酵起始時添加了300 mg/L磷酸氫二銨。按照上述工藝流程釀制而成的藍莓酒，其酒精度含量約為10%左右，殘糖量<4 g/L，顏色為紫紅色，具有藍莓品種特有的香氣。

表1 兩個品種藍莓果實及新酒的基礎理化指標Table 1 Basic parameters of berry and young wine inthis study

2.2 酶解處理對藍莓酒抗氧化物質及抗氧化活性的影響

經酶制劑AR2000處理前后， “密斯蒂”和“奧尼爾”藍莓酒抗氧化物質的含量及抗氧化活性見表2。

表2 不同加酶量處理對“密斯蒂”和“奧尼爾”藍莓酒抗氧化物質的影響Table 2 Effect of different enzyme addition on the antioxidants in “Misty” and “O’Neal” blueberry wines

注：同一行不同字母表示顯著性差異(P<0.05,n=3)，下同。

由表2可知，“密斯蒂”藍莓酒總花色苷、總酚以及總黃酮的含量均高于“奧尼爾”藍莓酒，并且“密斯蒂”藍莓酒的還原力和DPPH清除率也高于“奧尼爾”藍莓酒。比較不同加酶量處理可知，2個品種的藍莓酒在酶處理過后的花色苷明顯低于不加酶處理(P<0.05)，藍莓酒花色苷的含量隨著酶添加量的增加而下降，說明β-葡萄糖苷酶對花色苷具有水解作用[19]，過多添加可能會對藍莓酒的顏色品質產生一定的負面影響。酶處理對藍莓酒其他的抗氧化物質以及抗氧化活性的影響不大。從品質及經濟的角度考慮，選擇了25 mg/L的加酶量進行后續的香氣實驗。

2.3 酶解處理和自然陳釀對藍莓酒香氣物質的影響

采用頂空固相微萃取-氣質聯用(SPME-GC-MS)技術對藍莓酒香氣進行了分析，香氣成分的總離子流見圖1。

a-密斯蒂藍莓酒；b-奧尼爾藍莓酒圖1 藍莓酒香氣成分總離子圖Fig.1 Total ion chromatography of volatile compounds in blueberry wines

對“奧尼爾”和“密斯蒂”藍莓酒，加入β-葡萄糖苷酶和對照組以及陳釀1年組的藍莓酒香氣進行定量分析，結果見表3。共定量分析了22種香氣成分，其中包含9種酯類物質、1種醛類物質、9種萜類物質、2種醇類物質和1種酚類物質。根據這些化合物的質量濃度和香氣閾值，計算出OAVs(表4)，其中OAV大于1的物質有14種，被認為是藍莓酒中的香氣貢獻成分[20]。對比“密斯蒂”和“奧尼爾”2個品種藍莓酒的香氣成分，發現主要在萜類香氣物質上差異較大。“密斯蒂”藍莓酒的萜烯類香氣物質的種類和含量均高于“奧尼爾”藍莓酒。藍莓酒中萜類化合物OAVs大于1的有桉葉油素、芳樟醇，α-松油醇，桃金娘烯醇，香芹醇和β-香茅醇，其中芳樟醇和桃金娘烯醇的OAVs最高。這些萜類香氣物質多具有草香、木香、花香和樟腦樣香氣，賦予了藍莓酒特殊的風味。萜類物質在藍莓中存在非常廣泛，品種間差距較大[12]，但是目前市面上的藍莓酒大多未標明品種名稱，有的為混合品種釀制而成，這可能造成藍莓酒香氣品質參差不齊。本實驗結果說明品種差異對藍莓酒的香氣物質影響較大，所以原材料的選擇是保持藍莓酒香氣品質穩定性的重要因素之一。

表3 “密斯蒂”和“奧尼爾”藍莓酒中的揮發性香氣成分 單位：μg/L

注：同一行不同字母表示顯著性差異(P<0.05,n=3)；ND表示未檢出。*酶處理的條件為25 mg/L加酶量，30 ℃，酶解4 h。

表4 “密斯蒂”和“奧尼爾”藍莓酒中的揮發性香氣成分OAVs>1結果Table 4 Volatile compounds with OAVs>1 in “Misty” and “O’Neal” blueberry wine

續表4

序號香氣成分“密斯蒂”藍莓酒OAV“奧尼爾”藍莓酒OAV香氣閾值/(μg·L-1)對照酶處理?自然陳釀對照酶處理自然陳釀10桃金娘烯醇myrtenol7[27]31.132.731.416.419.018.711E-香芹醇E-carveol200[28]1.11.11.10.90.80.812β-香茅醇β-citronellol100[23]2.72.11.61.71.11.113苯乙醇phenylethyl alcohol14 000[23]1.21.21.210.011.512.114丁子香酚eugenol6[23]5.87.32.843.857.237.0

注：酶處理的條件為25 mg/L加酶量，30 ℃，酶解4 h。

酶處理和自然陳釀對萜類香氣物質的影響較大。酶處理和自然陳釀處理之間并無顯著差異。酶處理藍莓酒中2-茨醇和α-松油醇的含量顯著高于對照組(P<0.05)，而芳樟醇則顯著低于對照組(P<0.05)。并且2個品種的藍莓酒表現出類似的趨勢。在果實中，香氣物質一部分以游離態的形式存在，另外一部分則以糖苷鍵合態香氣前體的形式存在[21]。糖苷鍵合態前體物質本身不具有香氣活性，但是通過酸水解或者酶解的方式轉化為具有香味的香氣物質[21]。但是在藍莓中，糖苷鍵合態香氣物質的報道不多。本實驗的結果說明藍莓中的萜類物質有一部分以糖苷的形式存在，這一部分糖苷類物質會被β-葡萄糖苷酶水解，并且效果與自然陳釀過程中發生的緩慢酸水解作用相似。可見β-葡萄糖苷酶在藍莓酒增香中具有一定的應用潛力。

從表3可以看出，藍莓酒中酯類物質比較豐富，其中OAVs大于1的有丁酸乙酯，乙酸異戊酯，苯甲酸甲酯，己酸乙酯和辛酸乙酯。酯類物質主要在酵母發酵過程中產生，是產生果酒花香和果香的重要成分。在“密斯蒂”藍莓酒中，酶解處理后葵酸乙酯和琥珀酸二乙酯的含量顯著低于對照組(P<0.05)；而在“奧尼爾”藍莓酒中，酶解處理和陳釀組的己酸乙酯含量顯著低于對照組(P<0.05)，說明AR2000糖苷酶具有一定的酯酶活性，并且對于長鏈脂肪酸酯的水解作用效果更為明顯，這一結果也與之前報道的一致[22]。但是由于長鏈脂肪酸酯的OAVs大多低于短鏈的脂肪酸酯，例如本研究中葵酸乙酯和琥珀酸二乙酯的OAVs均小于1，說明這種酯酶的活性可能對整體風味的影響較為有限。

此外，藍莓酒中檢測到的醛類，醇類，酚類，其中OAVs大于1的有苯乙醇(玫瑰味)和丁子香酚(丁香味)。“奧尼爾”藍莓酒中的丁子香酚的含量明顯高于“密斯蒂”藍莓酒。所以“奧尼爾”藍莓酒丁子香酚的OAV(37.0～57.2)也明顯高于“密斯蒂”藍莓酒中丁子香酚的OAV(2.8～7.3)。說明丁子香酚可能是造成2種藍莓酒香氣差異的重要揮發性物質之一。相比于對照組，酶解處理使“密斯蒂”藍莓酒中的丁子香酚的含量顯著提高(P<0.05)，“奧尼爾”藍莓酒中丁子香酚在酶處理后也有升高但是相比于對照組不顯著，說明丁子香酚在藍莓中也有部分以糖苷鍵合態的形式存在，酶解處理能加速其水解釋放過程。酶解處理并未使醛類和醇類產生明顯差異，說明酶解對這些香氣物質的影響不大。

3 結論

本實驗利用單一品種的藍莓果進行果酒發酵，利用固相微萃取-氣相色譜-質譜法對2個品種的藍莓酒的香氣成分進行了分析，共定量檢測了22種香氣成分。實驗發現品種對藍莓酒的揮發性香氣成分具有一定影響。經過葡萄糖苷酶AR2000處理，藍莓酒花色苷的含量有所下降但是總酚、總黃酮以及抗氧化活性變化不大。對香氣進行氣相色譜的分析后發現，2個品種藍莓酒的部分萜類香氣物質以及丁子香酚均有不同程度的升高，而且都是良好的呈香物質，其效果類似于自然陳釀。說明藍莓的糖苷前體物質有很大的香氣挖掘潛力，酶處理能使其有更好的風味表現并且可以縮短陳釀時間。這對提升藍莓酒的增香工藝提供了良好的理論基礎。