葡萄抑菌附生細菌篩選鑒定及其結構表征

馮語嫣，劉曉凡，范青，陳開業，胡伊旻，辛志宏

(南京農業大學 食品科技學院，江蘇 南京，210095)

葡萄含水量高，易受微生物侵染，從而產生多種病害。目前，化學農藥是防治各種葡萄病害的主要措施，但頻繁使用農藥不僅破壞生態環境，而且威脅消費者的食用安全。因此，尋找安全、高效和無污染的替代措施將成為科學工作者面臨的重要研究課題。

生物防治(biological control)是利用各種有益生物或其產生的活性物質及分泌物,控制病、蟲、草群體的增殖,從而達到降低甚至消滅病蟲草害的目的。這類方法能夠保持生態平衡，無污染、不產生抗性，從而保證了人畜安全，避免了化學農藥防治帶來的弊病，在現代農業生產中日益受到重視。

植物附生菌(epiphyte)附著在植物根、莖、葉、果表面，通過一定方式與植物相互作用[1]。研究表明，多數植物或果實表面有大量的附生微生物，這些微生物可以產生結構各異、生物活性多樣的次級代謝產物[2]。如劉麗等[3]通過傳統培養結合分子生物學的方法，分離鑒定普洱古茶樹表皮附著多種微生物，如芽孢屬、青霉屬等，其中Bacilluspumilus對大部分葉圍微生物有不同程度的拮抗作用，產黃青霉菌(Peaicilliumchrysogenum)能產生青霉素，能抑制多種微生物的生長。因此，從各種植物中分離鑒定附生菌，深入研究其生物活性，對于防治各種農業病蟲害和發現新型殺蟲劑具有重要作用。

夏黑葡萄屬于歐美雜交品種，具有抗逆性強、適用范圍廣的特點，在早熟品種中綜合性狀優異，已成為我國主要的鮮食葡萄種類之一[4]。研究表明，夏黑葡萄的表皮附生豐富多樣的微生物。楊雨蒙等[5]從夏黑葡萄表皮分離鑒定孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)、近玫色鎖擲酵母(Sporidioboluspararoseus)和假絲酵母(Candidazemplinina)。張俊杰等[6]利用宏基因組高通量測序技術發現夏黑葡萄表皮細菌群落具有高度多樣性，從屬的水平上分析，菌落主要為乳酸菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬和假單胞菌屬等。其儲藏期除了與葡萄自身表皮結構破損程度、溫度、水分等環境因素有關，也取決于其表面的附生微生物種類等生物因素。葡萄外表的營養物質為這些附生微生物提供了良好的生存環境，這些附生菌進而產生活性物質如小分子量的抗菌物質、抗菌蛋白或多肽等，使其他病原菌難于生長[7]，保護葡萄果實健康生長。因而，篩選鑒定及結構表征夏黑葡萄表面的抑菌附生細菌，對于闡明夏黑葡萄表面微生物種類及其生長繁殖特性，開發安全有效的抑菌活性物質用以防控微生物病害具有重要意義。

本研究以夏黑葡萄為研究對象，利用平板劃線法分離純化培養得到附生細菌，提取基因組DNA、PCR擴增16S rDNA、基因序列測序，構建系統發育樹進行聚類分析，結合形態學觀察，確定菌種的種屬地位[8]。在此基礎上，以7種食源性致病菌為指示菌，采用打孔法進行抑菌實驗，篩選具有抑菌活性的附生細菌。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

夏黑葡萄：購買自南京市衛崗農貿市場。

7種供試致病菌均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)如表1所示。

表1 七種供試致病菌Table 1 Seven test pathogens

7種細菌及放線菌固體培養基由本實驗室配制(按100 mL計)：

LB培養基(g)：胰蛋白胨1，酵母提取物0.5，NaCl 1，瓊脂1.5～2。PDA培養基(g)：土豆20，葡萄糖2，NaCl 3，瓊脂2。高氏1號培養基(g)：可溶性淀粉2，K2HPO40.05，FeSO40.001，MgSO4·7H2O 0.05，KNO30.1，瓊脂1.5。淀粉-酪氨酸培養基(g)：可溶性淀粉1，酪蛋白0.1，K2HPO40.05，瓊脂1.75。GYM培養基(g)：葡萄糖0.4，麥芽提取物1，酵母提取物1，蛋白胨0.1，瓊脂1.75。丙氨酸-酪蛋白培養基(g)：酪蛋白0.2，丙氨酸0.4，天冬酰胺0.01，K2HPO40.05，瓊脂1.5。YPD培養基(g)：酵母提取物1，蛋白胨2，葡萄糖2，瓊脂2。

DNATaq酶、DNA marker及PCR相關試劑,南京諾唯贊生物科技有限公司；Omega細菌基因組試劑盒(Bacteria DNA Kit 50)及引物,上海捷瑞生物工程有限公司；瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒(Ver.3.0 D823A型)，日本TaKaRa公司；D102ApMD19-T載體,日本TaKaRa公司。

1.2 儀器設備

臺式恒溫振蕩器，江蘇太倉市實驗設備廠；數顯恒溫水浴鍋，上海江星儀器有限公司；臺式微量冷凍離心機(Microfuge 22R型)，美國 Beckman公司；梯度PCR儀(TP600型)，日本TaKaRa公司；電泳儀(DYCP-31DN型)，北京市六一儀器廠；紫外可見分光光度計(UV-2100)，上海尤尼柯公司；全自動數碼凝膠成像分析儀(JS-380C型)，上海培清科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 附生細菌的分離、純化

隨機取數顆試驗葡萄置于無菌研缽中研磨，經過濾得葡萄原液。取1 mL葡萄原液至裝有9 mL無菌水的試管中，振蕩搖勻，得濃度為10-1的葡萄稀釋液。同理，依次制備濃度梯度為10-2、10-3、10-4、10-5的葡萄稀釋液。取0.2 mL菌液涂布于上述7種固體培養基，每個稀釋濃度做3個平行，于37 ℃恒溫培養箱中倒置培養1～2 d。觀察菌落的特征與形態，挑取形態有差異的單菌落通過三區劃線分離法得到純化單菌落。形態學鑒定方法參考《常見細菌系統鑒定手冊》[9]和《伯杰細菌鑒定手冊》[10]。最后利用甘油管藏法于-70 ℃下保存菌種備用。

1.3.2 基因組DNA的提取

細菌基因組DNA的提取采用細菌基因組試劑盒(bacteria DNA Kit 50)[11]。提取的基因組DNA先進行溴化乙錠(ethidium bromide, EB)染色，再用質量分數為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(115 V,30 min)。基因組DNA-20 ℃保存備用。

1.3.3 16S rDNA基因片段的PCR擴增

16S區域的擴增選擇原核生物16S rDNA的通用擴增引物16S(F)(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)/16S(R)(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR擴增程序為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸100 s，共35個循環，最后72 ℃延伸7 min。PCR采用50 μL的反應體系，包括ddH2O 19 μL、2×TaqMaster Mix 25 μL、16S(F)2 μL、16S(R)2 μL、模板DNA 2 μL。PCR擴增產物經質量分數為1%瓊脂糖凝膠電泳分析結果。

1.3.4 PCR產物的回收和克隆

采用TaKaRa瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒Ver.3.0(D823A)回收PCR產物，純化產物與pMD19-T載體連接過夜，將其轉化至E.coliDH5α感受態細胞中。于含氨芐青霉素(Amp 100 μg/mL)的LB固體培養基平板上涂布轉化完成的菌液，37 ℃倒置培養12 h。隨機挑取白色單菌落，將其接種至含Amp的LB液體培養基中，于37 ℃、180 r/min下搖菌過夜培養。取1.6 μL菌液進行16S rDNA PCR擴增，引物為M13-RV(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)和M13-47(5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′)。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環，最后72 ℃延伸10 min。PCR采用20 μL的反應體系，包括ddH2O 6.8 μL、2×Taq Master Mix 10 μL、M13-47 0.8 μL、M13-RV 0.8 μL、菌液1.6 μL。

1.3.5 DNA序列測序和系統發育樹的構建

將含有目的DNA序列的菌液交由通用生物系統有限公司進行測序。獲得16S rDNA序列后，通過Ezbiocloud(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)網站進行序列比對。利用MEGA 6.0軟件(neighbor joining,NJ)構建系統發育樹，自展數為1 000。

1.3.6 附生細菌抑菌活性測試

利用LB固體培養基活化保藏菌株。挑取單菌落，將其接種至100 mL LB液體培養基中，搖床培養至OD值達到0.4～0.6。利用預加菌液傾注平板法[12]制備試驗平板，在每個平板上打5個孔，然后往孔中注入40 μL目標菌液，37 ℃恒溫培養4～6 h后觀察抑菌圈。

1.3.7 菌種發酵

經過抑菌試驗篩選出具有抑菌活性的微生物，將其接種于LB固體培養基，于37 ℃下使其活化。無菌條件下，用接種環從中蘸取菌體，接種于內裝15 mL LB液體培養基的小三角瓶內，于37 ℃、180 r/min下過夜培養形成種子培養液，按3%接種量接種于含100 mL LB液體培養基的三角瓶中，在37 ℃、180 r/min下發酵7 d。

1.3.8 細菌次級代謝產物粗提取

往發酵液中加入等體積丙酮破碎細胞，使其細胞內容物釋放出，靜置過夜后得含有次級代謝產物的菌體裂解液。將裂解液抽濾除去菌體殘渣，并置于旋轉蒸發儀上減壓濃縮一半體積得濃縮液。用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將其置于旋轉蒸發儀上蒸干。用適量有機試劑重溶即得次級代謝產物粗提物。

1.3.9 細菌次級代謝產物的鑒定

粗提物過有機濾膜(0.22 μm)后進行ESI-MS分析。質譜參數:電噴霧離子源(ESI)，500 ℃，氣簾氣25.0 psi，噴霧電壓5500.0 V，離子源氣1∶55.0 psi，離子源氣2∶50.0 psi。

2 結果分析

2.1 形態特征

經LB培養基平板劃線純化，37 ℃培育12 h后，察看菌株單菌落形狀特征如圖1所示。

菌株BDA-1、BDC-4、BDD-2、BDG-3、BDG-7的菌落呈圓形，菌株BDD-1、BDG-1、BDG-4、BDG-5的菌落呈不規則形狀；菌株BDA-1、BDD-1、BDG-1、BDG-4、BDG-3、BDG-5、BDG-7的菌株呈現白色，菌株BDC-4呈淡紅色，菌株BDD-2呈淡黃色；菌株BDA-1、BDC-4、BDG-1、BDG-5中心凸起，菌株BDD-1、BDD-2、BDG-4、BDG-3、BDG-7中心平整；菌株BDA-1、BDC-4、BDD-1表面光滑濕潤，菌株BDD-2、BDG-1、BDG-4表面粗糙干燥，菌株BDG-3、BDG-5、BDG-7表面粗糙濕潤。

圖1 九種菌株的單菌落形態Fig.1 Colony morphology of 9 strains

2.2 DNA序列測序和系統發育學分析

9種菌株的16S rDNA PCR擴增產物大小均在1 500 bp左右(圖2)，與理論值一致[13]。

圖2 九株附生細菌的16S rDNA序列PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification of 16S rDNA sequences of 9 epiphytic bacteria

以菌株BDC-4為例,16S rDNA序列經Ezbiocloud網站分析比對，發現與萎蔫短小桿菌相應序列的同源性最高，相似性達99.58%。通過MEGA6.0軟件利用NJ法構建系統發育樹，如圖3所示。菌株BDC-4與萎蔫短小桿菌聚為同一枝，自展值為100，親緣關系最近，鑒定其為萎蔫短小桿菌。

圖3 基于菌株BDC-4 16S rDNA序列構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic Construction Based on 16S rDNA Sequences of BDC-4 Strain

同理，將菌株BDG-1、BDG-3、BDG-4、BDG-5、BDG-7、BDD-1、BDD-2、BDA-1、BDC-4分別鑒定為假蕈狀芽孢桿菌(Bacilluspseudomycoide)、加拿大假單胞菌 (Pseudomonascanadensis)、節桿菌內生亞種(Arthrobacterendophyticus)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)、阿耶波多氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)、南極帕金格氏桿菌(Paeniglutamicibacterantarcticus)、Pseudomonasparalactis、巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium)、萎蔫短小桿菌(Curtobacteriumflaccumfaciens)，如圖3～圖7、表2所示。

圖4 基于菌株BDG-4 16S rDNA序列構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic construction based on 16S rDNA sequences of BDG-4 strain

圖5 基于菌株BDG-1，BDG-5，BDG-7及BDA-1 16S rDNA序列構建的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic construction based on 16S rDNA sequences of strains BDG-1, BDG-5, BDG-7 and BDA-1

圖6 基于菌株BDG-3與BDD-2 16S rDNA序列構建的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic construction based on 16S rDNA sequences of BDG-3 strain

2.3 抑菌活性分析

對從夏黑葡萄中共分離得到的9株附生菌株進行抑菌活性測定，結果顯示菌株BDG-5和BDD-2具有抑菌活性(如圖8所示)，抑菌效果見表3。

BDG-5(貝萊斯芽孢桿菌)對大腸桿菌有一定的抑菌活性，抑菌圈直徑小于10 mm；對白念球菌有較強的抑菌活性，抑菌圈直徑10～15 mm；對四聯球菌有很強的抑菌活性，抑菌圈直徑大于15 mm。BDD-2(P.paralactis)對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大于15 mm，抑菌活性很強；對于白念球菌，BDD-2與BDG-5的抑菌效果類似。

圖7 基于菌株BDD-1 16S rDNA序列構建的系統發育樹Fig.7 Phylogenetic construction based on 16S rDNA sequences of BDD-1 strain

表2 九株細菌16S rDNA 序列同源性分析比對結果Fig.2 16S rDNA sequence homology analysis alignment results of nine strains of bacteria

編號菌株編號同源菌株名稱登錄號覆蓋率/相似度/%1BDG-1Bacillus pseudomycoides DSM 12442(T)ACMX01000133100/99.932BDG-3Pseudomonas canadensis 2-92(T)AYTD01000015100/99.863BDG-4Arthrobacter endophyticus EGI 6500322(T)KM114214100/99.384BDG-5Bacillus velezensis CR-502(T)AY603658100/99.865BDG-7Bacillus aryabhattai B8W22(T)EF114313100/1006BDD-1Paeniglutamicibacter antarcticus SPC26(T)AM931709100/98.837BDD-2Pseudomonas paralactis WS4992(T)KP756923100/99.798BDA-1Bacillus megaterium NBRC 15308(T)JJMH01000057100/99.869BDC-4Curtobacterium flaccumfaciens LMG 3645(T)AJ312209100/99.58

圖8 BDG-5(a)、BDD-2(b)對白念球菌的抑菌效果圖Fig.8 Antibacterial effect of BDG-5(a),BDD-2(b) against Candida albicans

表3 對7種致病菌的抑菌活性結果Table 3 Antibacterial activity results for seven pathogenicbacteria

ABCDEFGBDG-1-------BDG-3-------BDG-4-------BDG-5+----+++++BDG-7-------BDD-1-------BDD-2----+++-++BDA-1-------BDC-4-------

注：A-大腸桿菌；B-恥垢分枝桿菌；C-產氣莢膜桿菌；D-枯草芽孢桿菌；E-金黃色葡萄球菌；F-四聯球菌；G-白念球菌；-：無活性；+：抑菌圈直徑<10 mm；++：抑菌圈直徑為10～15 mm；+++：抑菌圈直徑>15 mm。

2.4 發酵粗產物結構分析

對目標菌株發酵粗提物進行ESI-MS 分析，結果如圖9所示。菌株BDD-2的粗提物在陽離子模式下出現m/z1 058.712[M+Na]+、m/z1 044.673、m/z1 030.657的碎片離子峰，或為m/z1 058.712、m/z1 044.673[M+H]+、m/z1 030.657，推測這一組物質為脂肽物質surfactin或iturin C；此外，還出現了m/z1 074.689[M+K]+、m/z1 046.618、m/z1 102.681的碎片離子峰，推測這一組物質為surfactin。以上數值說明該化合物的分子量為1 036，通過對比脂肽抗生素各種類的理論分子質量，推斷P.paralactis發酵可能產生環脂肽類化合物surfactin。同時，從圖9中可發現,在相同ESI-MS模式下出現m/z1 080.684[M+Na]、m/z1 096.645[M+K]的離子峰，1 044為脂肽類家族iturin的iturin C的分子質量，推測P.paralactis的發酵產物可能含有iturin C。

圖9 菌株BDD-2發酵產物質譜圖Fig.9 Mass spectrometry of strain BDD-2 fermentation product

從圖10中可見，貝萊斯芽孢桿菌的粗提物在陽離子模式下出現m/z1 058.730[M+Na]+、m/z1 044.691、m/z1 030.661及m/z1 074.752[M+K]+、m/z1 102.659的離子峰碎片，以上均為Surfactin類化合物的特征分子離子質量[14]。本實驗也得到了含鈉同系物為m/z1 065.595、m/z1 051.625、m/z1 079.640、m/z1 093.653，含鉀同系物為m/z1 081.577、1 095.647的分子離子峰，為iturin A的特征離子峰，與已有文獻報道的經LC-MS分析和HPLC分析得到的結果一致[15]，故推測該物質屬于iturin A族衍生物。根據已有文獻報道的Bacillussp. LM7產生的具有生物活性的bacillomycin D脂肽物質，測得C14 bacillomycin D的分子離子峰為m/z1 032.5426[16]，本實驗測得了m/z1 018.803[M+H]+的離子峰，與前者相差一個亞甲基，還有m/z1 040.790[M+Na]+、m/z1 056.836[M+K]+，以上均可推測貝萊斯芽孢桿菌發酵產生了脂肽家族iturin中的物質bacillomycin D。

圖10 菌株BDG-5發酵產物質譜圖Fig.10 Mass spectrometry of Strain BDG-5 fermentation product

3 結論與討論

本研究從夏黑葡萄中分離鑒定了9株細菌，抑菌實驗表明BDG-5和BDD-2具有顯著的抗菌活性，運用16S rDNA序列分析分別鑒定為B.velezensis和P.paralactis。2株菌進一步發酵后，提取發酵產物，經ESI-MS分析初步確定發酵產物中具有抑菌活性化合物的結構分別為surfactin、iturin C、iturin A和bacillomycin D。

金疏桐等[17]于2017年首次從盾葉薯蕷植物中分離出貝萊斯芽孢桿菌，其次級代謝產物通過抑菌試驗表現出了廣譜的抗病原細菌活性，同時在一定程度上也顯示了拮抗耐藥菌的能力，但未闡明抗菌作用物質及結構特征。宗英等[18]利用平板對峙法，從感染赤霉病的麥穗上分離篩選出了具有顯著抑制禾谷鐮刀菌活性的附生細菌，并將其鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，通過氣相色譜-質譜法對發酵液中的揮發性物質進行了分析，其中純化的4種單成分對鐮刀菌生長的抑制效果明顯。此外，一些芽孢桿菌在生長代謝過程中，會由非核糖體合成表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)、芬薺素(fengycin)三大類常見的具有表面活性的脂肽[19]。其中surfactin除具有表面活性外，還可抑制細菌、病毒、真菌、支原體的生長[20]。iturin族是一類小分子環脂肽類物質，抗真菌效果通常顯著，抗細菌作用有限，某些成員具有溶血作用[21]。基于此，本研究發現從夏黑葡萄中分離出的菌株BDG-5產生了具有廣譜抗致病菌性的次級代謝產物，故推測其屬于脂肽家族。通過對比脂肽抗生素各種類的理論分子質量(目標分子質量為1 000～2 000)，推測B.velezensis菌種發酵產生了surfactin及iturin家族中的iturin A與bacillomycin D。B.velezensis屬于芽孢桿菌屬，本研究發酵得次級代謝產物中的surfactin物質與楊柯等[22]從鹽生海蘆筍中分離得到2株具有抑菌活性的芽孢桿菌屬的發酵產物一致。目前的研究[23]已闡明，通過芽孢桿菌與植物間的相互作用，這些脂肽物質在促進植物宿主防御機制上起到了重要作用，芽孢對干旱的高抗性在抗菌物質的穩定形成及植物原料的貯存運輸上起著重要的作用。因此，夏黑葡萄的生長發育及采摘后的運輸儲藏與其表面的附生微生物有密切的聯系。

NEUBECK等自牛乳中分離得到P.paralactis，首次明確為新種[24]，但僅僅研究了其形態學特征及生理生化特性，并沒有對其發酵產物的生物活性及其化學結構進行研究。本研究發現菌株BDD-2產生了2個主要抗致病菌環脂肽surfactin和(或)iturin C，其抑制金黃色葡萄球菌與白念球菌的活性較強，值得進一步深入研究。

本研究結果表明，葡萄表面含有種類多樣的附生菌，其中有些菌株能夠產生具有顯著抑菌活性的次級代謝產物——環脂肽，該研究結果對深入研究附生菌的抑菌機理，從分子水平揭示生物防控的機制，為拮抗菌的定向培育、改造工程提供理論依據[25]，也為生產上開發新型殺菌劑提供參考。