長鏈非編碼RNA LINC01503在哮喘患兒中的表達及作用的病例對照研究

夏 莉 劉麗娟 王 香 孫立成 付勁蓉 韓 曉 錢莉玲 周玉峰,2

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是兒童呼吸道最常見的慢性疾病之一，主要表現為氣道慢性炎癥與氣道高反應性[1]。哮喘是由遺傳、環境和表觀遺傳學因素共同作用而導致的一種炎癥性疾病[2, 3]。流行病學研究顯示，近年來哮喘的發病率呈快速上升的趨勢[4]，DNA序列不可能在短期內發生劇烈變異，因而表觀遺傳學因素的改變可能在其中發揮更大作用。表觀遺傳學調控包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA等[5]。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類本身不編碼蛋白、轉錄本長度>200個核苷酸的RNA分子，可在多層面上(表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等)調控基因的表達，已經成為免疫學關注的熱點[6]。巨噬細胞是呼吸道最主要的炎癥細胞，在哮喘的發病中起著重要作用[7]。巨噬細胞根據激活途徑的不同，可分為經典激活M1型和替代激活M2型，巨噬細胞的活化狀態可直接影響炎癥性疾病的發生、發展和轉歸[8]，目前有關LncRNA對巨噬細胞極化的調控及在哮喘發病中的作用還少有報道。有報道LncRNA LINC01503能促進細胞外調節蛋白激酶(ERK)的活化，因此推測LncRNA LINC01503對巨噬細胞極化具有調控作用，本研究期望為非編碼RNA調控的巨噬細胞極化在哮喘疾病中的作用提供實驗證據。

1 方法

1.1 研究設計 病例對照研究。哮喘組為門診診斷哮喘的患兒，健康對照組為健康體檢兒童，檢測兩組外周血單個核細胞(PBMC)中LncRNA LINC01503的表達情況。通過siRNA敲低THP1細胞系中LncRNA LINC01503的表達，探索LncRNA LINC01503對巨噬細胞M1和M2型極化的調控作用。

1.2 倫理 本研究實驗方案得到了復旦大學附屬兒科醫院(我院)倫理委員會的批準。

1.3 哮喘組納入和排除標準 納入同時滿足以下各項的連續患兒：①2017年8月26日至2018年1月11日我院呼吸科門診喘息反復發作且未正規治療的患兒，②由同1名主治醫生接診并參照2016版《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[9]診斷為哮喘，③獲得患兒家長口頭知情同意采血用于本研究檢測。排除合并其他呼吸道疾病(如肺炎)、心血管系統疾病、神經系統疾病的患兒。

1.4 健康對照組納入和排除標準 納入在我院健康體檢門診行體檢的兒童，根據哮喘組入組患兒的性別和年齡按1∶2進行匹配。獲得對照組兒童家長的口頭知情同意，采血用于本研究檢測。排除有過敏史及近期呼吸道感染者。

1.5 PBMC分離 采用Ficoll-Hypaque(GE Healthcare)梯度離心法。將血液用PBS等體積稀釋，緩慢加入等體積的Ficoll-Hypaque中，400 g 緩升緩降離心30 min，吸取第二層單個核細胞懸浮液，加入新的離心管，離心，PBS洗2次，所獲得細胞即為PBMC。

1.6 細胞培養 THP1細胞購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。細胞培養條件：在含有10%胎牛血清(Gibico)、100 U·mL-1青霉素、50 μg · mL-1鏈霉素的1 640(Gibico)培養基中，37℃、5% CO2濃度的條件下培養。巨噬細胞分化：500 ng·mL-1佛波酯(PMA，Sigma)刺激THP1細胞48 h，換液，棄掉懸浮細胞，貼壁細胞即為分化的巨噬細胞。

1.7 siRNA 轉染 siRNA序列見表1，由上海吉瑪生物公司設計。siRNA轉染濃度為200 nmol·L-1，使用LipoRNAiMax(invotrogen)進行轉染。 細胞于轉染后第2 d進行換液，轉染48 h后加LPS或IL-4刺激巨噬細胞。

1.8 RT-qPCR 在炎癥狀態下，外周血單核細胞會進入肺部轉化為巨噬細胞[10]。巨噬細胞是呼吸道數量最多的免疫細胞，在不同環境因素的刺激下會向不同的方向活化，伴隨一系列基因的表達發生動態變化，從而對疾病發揮不同的調控作用[8]。為探究LINC01503在巨噬細胞不同活化過程中其表達是否發生改變，分別采用LPS 200 ng·mL-1和IL-4 20 ng·mL-1誘導巨噬細胞向M1和M2方向活化，RT-qPCR檢測LINC01503的表達情況。采用Trizol(Ambion)提取總RNA，用Takara RR037A 反轉錄試劑盒將Total RNA反轉錄成cDNA。用上海翊圣生物科技公司HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix(No Rox)進行qPCR熒光定量檢測。Primer premier 5 用于引物設計，序列見表1，引物由上海生工公司合成。采用GAPDH作為內參，數據分析采用2-△△CT法。

表1 siRNA序列及RT-qPCR引物序列

1.9 Western blot 分離膠和濃縮膠配膠試劑購于上海碧云天生物公司及上海生工公司。Western blot 所使用抗體: P65、p-P65(ser536)、P38、p-P38: (Thr180/Tyr182)、JNK、p-JNK(Thr183/Tyr185)、ERK1/2、p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、STAT6和p- STAT6 (Tyr641)均購于美國Cell Signaling Technology 公司。電泳、轉膜、顯影等相關儀器購于美國Bio-rad 公司。Western blot具體實驗步驟參照抗體官網使用說明書。

2 結果

2.1 一般情況 符合本文哮喘組和健康對照組納入和排除標準的樣本分別為28例和46例，28例哮喘患兒均為輕癥哮喘。哮喘組男∶女為19∶9，中位年齡5.0(2～11)歲；外周血平均嗜酸性粒細胞數每微升(425.8±248.7)個(正常值 60～300)，總IgE陽性率50.0%，氣道阻力升高占74%。健康對照組男∶女為29∶17，中位年齡7.5(4～13)歲，均未行外周血嗜酸性粒細胞、IgE及氣道阻力檢測。

2.2 哮喘組和健康對照組PBMC中LINC01503的表達 圖1A 顯示，與健康對照組相比，LINC01503在哮喘組中的表達顯著增高[(1.63±0.10)vs(1.01±0.04)，t=6.163，P<0.000 1]。圖1B顯示， 在哮喘組中，LINC01503的表達量與嗜酸性粒細胞的數量不相關(P=0.40)。

2.3 LINC01503 在巨噬細胞不同極化過程中的表達 LPS刺激巨噬細胞后，LINC01503表達下調(圖2A)。IL-4刺激巨噬細胞后，LINC01503表達上調(圖2B)。

2.4 LINC01503對巨噬細胞極化的影響 本文設計的siRNA能有效降低LINC01503的表達，敲低效率80%以上(圖3A)。在敲低LINC01503后，M2型巨噬細胞活化標志基因CD206和CD209表達明顯上調(圖3B、C)，M1巨噬細胞活化的標志基因IL-6 、TNF-α和CXCL10的表達顯著降低(圖3D、E、F)。

2.5 LINC01503對巨噬細胞極化信號通路的影響 ①敲低LINC01503，LPS刺激巨噬細胞向M1方向極化，Western blot檢測了對NF-κB及MAPK信號通路的影響，P65、P38和JNK的磷酸化水平未受明顯影響，ERK的磷酸化水平明顯降低(圖4A)。②Western blot顯示，敲低LINC01503后對IL-4信號通路中信號轉導子與轉錄激活子6(STAT6)磷酸化的影響不明顯(圖4B)。

圖1LINC01503在哮喘患者中的表達顯著升高

注 A:采用RT-qPCR法檢測LINC01503在哮喘組和健康對照組PBMC中的表達；B：LINC01503變化倍數與嗜酸性粒細胞計數的相關性分析。****，P<0.000 1

圖2LINC01503在巨噬細胞極化中動態表達

注 A：LPS刺激巨噬細胞向M1方向極化，B：IL-4刺激巨噬細胞向M2方向極化，采用RT-qPCR法檢測LINC01503在巨噬細胞極化中的動態表達

圖3LINC01503對巨噬細胞極化的調節

注 A:siRNA敲低LINC01503的表達；IL-4刺激已經敲低LINC01503表達的巨噬細胞24 h, RT-qPCR檢測CD206(B)和CD209(C)的表達；LPS刺激已經敲低LINC01503表達的巨噬細胞1.5 h, RT-qPCR檢測IL-6(D)、TNF-α(E)和CXCL10(F)的表達。*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1

圖4LINC01503促進ERK磷酸化

注 A：敲低LINC01503，LPS刺激15 min，Western blot檢測了對NF-κB及MAPK信號通路的改變情況；B：敲低LINC01503后IL-4刺激15 min，檢測對信號通路中STAT6磷酸化的影響

3 討論

哮喘如今被視為一組異質性疾病，不同的哮喘表型具有不同的發病機制[11]，但炎癥是哮喘發病的核心環節[1, 12]。既往對哮喘發病機制的研究主要集中于Th1/Th2細胞失衡、肥大細胞及嗜酸性粒細胞等釋放的炎癥因子對哮喘的影響 ，而巨噬細胞在哮喘發病中的作用并未引起足夠重視[7, 13]。

巨噬細胞作為聯系固有免疫和適應性免疫的橋梁，在許多慢性炎癥性疾病和免疫性疾病如肥胖、動脈粥樣硬化、糖尿病、肝臟纖維化、潰瘍性結腸炎以及腫瘤的發生發展中均發揮著重要的調控作用[14]。巨噬細胞作為呼吸道最豐富的免疫細胞，對氣道的炎癥及免疫反應發揮著重要的調控作用[13]。巨噬細胞的不同活化類型與哮喘的嚴重程度及疾病的異質性有很大關系[15, 16]。在以Th2免疫反應為主的哮喘患者中，呼吸道巨噬細胞在高Th2炎癥因子的刺激下向M2方向活化，活化的M2巨噬細胞可以高表達一系列細胞因子及趨化因子，繼而促進Th2免疫反應而加重哮喘；在非Th2免疫反應的環境中，巨噬細胞被誘導向M1方向活化，活化的M1巨噬細胞可高表達IL-6、TNF-α及活性氮、氧分子，促進機體的Th1、Th17免疫反應，降低機體對激素治療的敏感性，從而導致難治性哮喘的發生[3, 17]。巨噬細胞活化與刺激因素之間往往形成正反饋調控，因而無論在Th2型或非Th2型過敏性哮喘中，巨噬細胞活化不平衡的結果均能加重哮喘。因此，探索能夠調控巨噬細胞活化的分子或許能為不同類型哮喘的發病及治療提供新的思路[18]。

M1型巨噬細胞主要由LPS和IFN-γ等激活，MAPK和NF-κB等信號通路在其中發揮關鍵作用；M2型巨噬細胞主要由IL-4和IL-13等激活，主要涉及JAK-STAT-6信號通路[19, 20]。有研究發現長鏈非編碼RNA LINC01503可與ERK2結合，抑制雙特異性蛋白磷酸酶6(DUSP-6)對ERK2的去磷酸化作用，導致ERK磷酸化增加，而促進腫瘤的發生與發展[21]。但LINC01503對巨噬細胞的活化及哮喘中的作用尚未見報道。因為LINC01503參與MAPK信號通路的調控，推測LINC01503可能會參與巨噬細胞極化的調控。本研究顯示，與健康對照兒童相比，LINC01503 高表達于哮喘組患兒；在M2活化的巨噬細胞中，LINC01503表達增高，而在M1活化的巨噬細胞中LINC01503表達下降。敲低LINC01503能上調巨噬細胞M2標志基因CD206和CD209表達, 下調M1標志基因如IL-6、TNF-α和CXCL10的表達。說明LINC01503能促進巨噬細胞向M1活化，抑制其向M2活化。在蛋白水平，本研究發現，LINC01503能促進ERK的磷酸化，但對M1活化有關的NF-κB、p38、JNK及M2信號轉導分子STAT6等無顯著影響，說明在巨噬細胞中，LINC01503主要通過促進ERK磷酸化促進M1的活化而抑制M2的活化。

兒童哮喘與成人有所不同，主要以Th2型過敏性哮喘為主。LINC01503可被Ⅱ型免疫反應因子如IL-4誘導表達，高表達的LINC01503能抑制巨噬細胞M2型活化，促進M1型活化，從而維持巨噬細胞活化的平衡。因此LINC01503可通過促進巨噬細胞活化的平衡，從而在一定程度上緩解哮喘的病情，這一結果與本文哮喘組患兒主要為輕度哮喘患者事實相一致。綜上，LINC01503可通過負反饋調控巨噬細胞活化而促進巨噬細胞不同活化類型之間的平衡進而緩解疾病的進展。LINC01503有望成為判斷病情的初步指標及治療哮喘的潛在分子靶點。