LRBA基因突變2例病例報告

劉璐瑤 王 瑩 董小龍 林 麗 孫金嶠 王曉川

1 病例資料

1.1 病例報告

例1 男，13歲，因“PLT、Hb反復下降6年余”于2016年1月25日至復旦大學附屬兒科醫院(我院)就診。

患兒于2009年無明顯誘因出現皮膚淤青，就診于當地醫院，發現PLT、Hb下降，考慮自身免疫性貧血、PLT減少性紫癜。曾給予激素、免疫球蛋白治療后PLT升至正常，溶血性貧血較前好轉，激素減量時病情易反復。2010年7月在上海市某兒童醫院行骨髓細胞學檢查：骨髓增生明顯活躍，粒紅比倒置，粒系增生相對減低，紅系增生明顯活躍，巨核系增生活躍。2013年就診于我院，考慮為自身免疫性溶血性貧血，免疫功能檢查示免疫球蛋白減低。2013至2016年接受激素治療，曾患真菌性肺炎。

患兒系G1P1，足月剖宮產。父母身體健康，否認近親結婚及家族相關遺傳性疾病史。既往有丙種球蛋白、紅細胞懸液、冷沉淀、白蛋白和纖維蛋白原輸注史。

體格檢查：神志清楚，反應良好，精神可，貧血貌。兩肺呼吸音粗，未及啰音。腹壁松弛，腹部皮紋明顯。肝肋下3 cm，劍突下3 cm，質韌，有觸痛。脾肋下6 cm，質韌，有觸痛。腹部叩診鼓音，腹壁靜脈顯露，移動性濁音陰性。因長期服用激素表現為庫欣貌，向心性肥胖，發育落后。

實驗室檢查：血常規WBC 7.3×109·L-1，L 1.8×109·L-1，N%為70.9%，CRP 16 mg·L-1；RBC 2.42×1012·L-1，Hb 55 g·L-1，網織紅細胞比例14.3%，抗C3陽性，抗IgG陽性，Coombs試驗血型單特異性抗體陽性，直接抗人球蛋白試驗陽性提示溶血性貧血。血生化ALT 206 IU·L-1，AST 255 IU·L-1；自身抗體陰性。外周血白細胞中EBV-DNA陽性(4.13×104拷貝數·mL-1)；真菌G試驗89.0 pg·mL-1；肺泡灌洗液宏基因檢測真菌弱陽性。

例2 男，3個月2 d，因“反復PLT減少3個月”于2018年8月7日至我院就診。

患兒出生后因“氣促，吐沫10 min”于外院就診。X線胸片提示新生兒肺炎，血常規PLT 19×109·L-1, CRP 9 mg·L-1, WBC 28.2×109·L-1，N% 85.4%，予抗感染，靜脈輸注丙種球蛋白2.5 g、PLT 60 mL，潑尼松1 mg·kg-1口服。黃疸明顯，診斷為新生兒高膽紅素血癥。病程中無明顯誘因出現發熱，伴外耳道癤腫破潰流膿，全身皮膚可見散在出血點。骨髓穿刺結果提示：骨髓增生活躍(粒系、紅系)，PLT較少見，可見巨核細胞，嗜酸性粒細胞比值偏高。生后有反復腹瀉，蛋花樣便，1月齡停母乳后好轉。

患兒系G2P1，41+1周產鉗助產出生，出生體重3 850 g，出生無窒息搶救史。母親第1胎于孕10周胎停。父母身體健康，否認近親結婚及家族相關遺傳性疾病史。

體格檢查：神志清楚，反應良好，精神可，發育正常；全身皮膚可見散在少許針尖大小出血點，全身淺表淋巴結未觸及腫大，腹軟，肝脾肋下未觸及；四肢肌力、肌張力可，中樞神經系統檢查未見異常。

實驗室檢查：血常規WBC 9.6×109·L-1，L 6.1×109·L-1，N 1.02×109·L-1，嗜酸性粒細胞1 860個/μL，Hb 94 g·L-1，RBC 3.98×1012·L-1，PLT 10×109·L-1，網織紅細胞百分比 1.8%，CRP<8 mg·L-1。Coombs試驗陰性。尿有機酸質譜結果顯示，3-羥基-苯乙酸-2、4-羥基-苯乳酸-2水平略高于正常。靜脈血EBV DNA陰性，CMV DNA陰性；外周血白細胞EBV DNA陰性。自身抗體陰性。

1.2 影像學檢查 例1 CT報告顯示兩肺廣泛多發斑片、結節影，縱隔多發腫大淋巴結影(圖1A)，考慮真菌感染的可能。B超報告膽囊內密集占位，提示真菌感染(圖2A)；肝腫大，肝臟質地欠佳，巨脾(圖2B)，脾靜脈增寬。例2 B超報告肝質地欠佳(圖2C)；雙側頸部探及淋巴結，雙側腋下淋巴結腫大；雙側腹股溝淋巴結輕度腫大；脾臟未見明顯局灶性占位。腹部腸腔內大量氣體。

圖1例1CT檢查結果

注 A：兩肺廣泛多發斑片、結節影，縱隔多發腫大淋巴結影。B：兩肺透亮度尚可，廣泛多發斑片、結節影較前有明顯好轉

圖22例患兒B超檢查結果

注 A：例1 膽囊內密集占位；B：例1巨脾；C：例2肝質地欠佳

1.3 免疫功能評價

1.3.1 常規免疫檢查 采用免疫比濁法檢測免疫球蛋白IgG、IgM和IgA的水平。使用熒光標記單克隆抗體分別標記外周血淋巴細胞亞群，其中抗CD19標記B細胞，抗CD3、抗CD8抗體標記CD8+T細胞，抗CD3、抗CD4抗體標記CD4+T細胞，抗CD16CD56抗體標記NK細胞，用流式細胞儀(BD Biosciences, San Jose, CA)分析結果。

1.3.2 淋巴細胞精細分型 取混勻的 50 μL肝素抗凝全血于流式管中，加入不同熒光素標記的小鼠抗人APC-CD19、BV421-CD27、BV510-IgD、PE-CD24和PERCP-CY5.5-CD38檢測B淋巴細胞不同分化發育亞群；使用小鼠抗人PE-TCRαβ、BV421-TCRγδ 、PERCP-CY5.5-CD3、FITC-CD4、BV510-CD8、APC-CD27和PE-CY7-CD45RA檢測T淋巴細胞不同分化發育亞群；混勻后室溫避光孵育；加入裂紅素裂解紅細胞。使用PBS緩沖液重懸后用BD Diva 軟件上機獲取數據并分析。

1.3.3 免疫功能評價 例1 IgG、IgA和IgM均下降，CD3+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞增多，CD4+T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞減少(表1)。例2 IgG升高，IgA和IgM在正常范圍，CD4+T淋巴細胞增多，CD8+T淋巴細胞減少，B淋巴細胞和NK細胞均在正常范圍(表1)。精細分型結果提示2例初始B細胞比例增高、記憶性B細胞降低(圖3、表1)；例1漿細胞(0.1%)、初始CD4+T細胞(1.6%)和CD8+T細胞(6.9%)比例下降，中央記憶性CD4+T細胞(81.5%)和CD8+T細胞(37.2%)比例增高(圖3、4)；例2 T淋巴細胞亞群精細分型大致正常(圖4)。

1.4 基因檢測 取得患兒父母知情同意后，抽取患兒及其父母外周靜脈血2 mL(EDTA 抗凝)，提取基因組 DNA(QIAGEN公司)，采用高通量測序法行全外顯子組測序。采用Sanger法和熒光定量PCR分別對點突變和缺失突變進行驗證。2例均為LRBA基因復合雜合突變(圖5A)。例1為c.1933C>T(p.R645X，母源)雜合突變和29號外顯子缺失雜合突變(父源)，c.1933C>T導致645位編碼精氨酸的密碼子突變為終止密碼子，導致蛋白翻譯提前終止，引起LRBA蛋白的異常截短，該突變位點在HGMD數據庫中尚未報道(圖5)。例2為c.3778G>C(p.A1260P, 母源)和c.1570G>A(p.G524S, 父源)復合雜合突變(外院檢測)。c.3778G>C(p.A1260P)在HGMD數據庫中尚未報道，經mutation taster預測為致病突變；c.1570G>A(p.G524S)為HGMD數據庫中已報道的致病突變(CM1720278)。

表1 2例患兒免疫功能檢查

圖3 2例患兒B淋巴細胞亞群精細分型結果

圖4 2例患兒CD4+ T和CD8+ T淋巴細胞亞群精細分型結果

圖5基因檢測結果

注 A：LRBA蛋白結構示意圖及2例患兒突變分布(例2：p.G524S和 p.A1260P)；B：例1及其母親均檢測到LRBA基因15號外顯子c.1933C>T(p.R645X)雜合突變；C：例1家系LRBA(exon 29)熒光定量檢測結果，例1及其父親均檢測到LRBA基因 29號外顯子雜合缺失

1.5 治療 例1入院后完善相關檢查，給予甲潑尼龍(80 mg q12 h)、免疫球蛋白(共40 g)抑制免疫反應、減少紅細胞破壞；輸注紅細胞；頭孢哌酮舒巴坦、伏立康唑抗感染，效果不佳，后加用卡泊芬凈抗真菌治療，肺部真菌感染癥狀好轉(圖1B)，Hb及PLT逐漸恢復正常，網織紅細胞逐漸下降，患兒病情好轉，定期輸注丙種球蛋白。因家庭原因未進行造血干細胞移植(HSCT)。

例2予靜脈輸注丙種球蛋白2.5 g及PLT，PLT較前無明顯上升。目前已行HSCT，臨床好轉中。

2 討論

LRBA (LPS-responsive beige-like anchor protein) 缺陷是LRBA基因發生雙等位基因功能缺失性突變所引起的一種原發性免疫缺陷病[1]。LRBA基因位于4q31.3，編碼LRBA蛋白，是BEACH-WD40蛋白家族成員之一，普遍存在于人體內，在免疫細胞尤其是淋巴細胞中高度表達。目前LRBA缺陷具體的發病機制仍然不清楚，但是相關研究發現LRBA蛋白與蛋白激酶A結合，主要調節胞內囊泡的轉運過程，有助于免疫效應分子如細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA-4)的分泌和膜沉積過程[2]。CTLA-4在活化的T細胞和調節性T細胞(Tregs)上表達，通過與共刺激分子CD28(CD80和CD86的配體)競爭或者直接通過跨細胞胞吞作用去除抗原遞呈細胞上的這類配體，從而發揮免疫抑制作用[3, 4]。 LRBA蛋白能夠穩定CTLA-4胞漿內尾端，防止其被溶酶體降解，LRBA缺陷導致活化的CD4+T細胞和Tregs上CTLA-4 的水平降低，從而出現一系列免疫失調的表現[2]。

LRBA缺陷在2012年[1]被提出后最先被歸為常見變異性免疫缺陷病(CVID)[1, 5]。目前多個研究發現部分LRBA缺陷的患者表現為自身免疫性疾病，如炎癥性腸病、類免疫失調-多發內分泌病-腸病-X染色體連鎖(IPEX)綜合征和類自身免疫性淋巴增生綜合征(ALPS)等[6, 7]。LRBA缺陷主要表現為一種表型廣泛的免疫綜合征，在2017年免疫缺陷病分類中將其歸為免疫失調性疾病[8]。LRBA缺陷的臨床表現復雜多樣，主要包括低丙種球蛋白血癥、自身免疫性疾病、反復感染、免疫失調、肝脾腫大、肺部疾病以及易感EBV等，其中低丙種球蛋白血癥和慢性腹瀉最常見[9, 10]。LRBA缺陷患者免疫功能的異常主要包括IgG抗體產生減少，特異性抗體免疫應答缺陷，T淋巴細胞的增殖和活化功能缺陷，Treg細胞減少以及B淋巴細胞的自噬減少等。大多數LRBA缺陷的患者B淋巴細胞亞群的計數減少，尤其是類別轉換記憶性B細胞和漿細胞[1, 11]。

本文報告的2例LRBA缺陷患兒均有反復感染、血細胞減少和腹瀉等自身免疫性疾病的表現。淋巴細胞亞群精細分型結果提示，2例患兒初始B細胞比例明顯增高，記憶性B細胞比例降低。例1還表現為免疫球蛋白IgG、IgA、IgM水平下降，CD3+T和CD8+T淋巴細胞增多，CD4+T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞減少，漿細胞、初始CD4+T和CD8+T淋巴細胞比例下降，中央記憶性CD4+T和CD8+T淋巴細胞比例明顯增高等。例1的臨床表現以及免疫表型符合之前所報道的LRBA缺陷患兒的表現，但是例2與例1的表型不完全一致，這種現象說明LRBA缺陷復雜多樣的臨床表現可能受到發病的年齡、感染以及外界環境因素等的影響。兒童若出現早發型低丙種球蛋白血癥、嚴重的自身免疫性疾病、炎癥性腸病、淋巴組織增生和反復呼吸道感染等臨床表現，需考慮LRBA缺陷可能。

目前LRBA缺陷的治療手段主要包括阿巴西普靶向治療和HSCT。其中，HSCT也可以用于伴發嚴重疾病的患者[12]。阿巴西普是一種 CTLA-4免疫球蛋白融合藥物，通過與抗原提呈細胞上的 CD 80/86 結合抑制T 細胞激活，目前用于治療類風濕關節炎。之前有報道1 例CTLA-4 功能性突變的女孩在接受阿巴西普治療后，其自身免疫癥狀有所改善，FOXP3表達升高，Treg細胞功能恢復正常[13]。部分LRBA缺陷的患者接受阿巴西普治療后，間質性肺病、自身免疫性疾病以及免疫表型都有了顯著的改善[14]。但是血細胞減少等臨床表現對阿巴西普治療的反應性比較差。

HSCT是根治LRBA缺陷的主要手段，相關臨床研究[12, 15-18]報道，已有12例LRBA缺陷患者接受了HSCT治療，總生存率為67% (8/12), 其中有6例臨床表現好轉[19]。本文例2行HSCT，目前正處于臨床好轉階段，例1因家庭原因目前還沒有接受HSCT治療。目前接受HSCT治療的LRBA缺陷的病例仍有限，效果尚待進一步研究。對于部分臨床表現復雜、相關并發癥嚴重的LRBA缺陷的患兒，若常規治療無效，可盡早行HSCT。