疑似遺傳代謝病的高危新生兒行質譜檢測與高通量測序檢測診斷準確性研究

徐素華 楊 琳 吳冰冰 孫衛華 陸 煒 王慧君 程國強 周文浩

遺傳代謝病(IMD)是一組病種繁多的單基因病，新生兒期發病的IMD往往病情危重，但部分患兒經及時精準干預，預后會得以改善[1]。串聯質譜技術可同時對多種代謝物進行快速檢測，是目前臨床常用的檢測IMD的方法，但其檢測病種有限，檢測結果易受患兒病情和治療等多種因素影響，可造成一定的誤診及漏診[2]。高通量測序(NGS)通過對多個基因進行檢測而提供可靠的分子診斷，能彌補質譜技術的不足[3]。目前尚缺乏大樣本的關于NGS和質譜檢測對NICU中IMD高危患兒篩查效能的研究。

1 方法

1.1 研究設計 以包含2 742個已知致病基因捕獲的NGS為金標準，以包含20種氨基酸代謝病、12種脂肪酸代謝病和19種有機酸代謝病的質譜(質譜液相色譜-串聯質譜和氣相色譜-質譜檢查)檢測為待測標準，對NICU中IMD高危患兒行遺傳代謝病篩查，比較NGS和質譜的篩查效能。

1.2 檢測人群納入標準 同時符合以下2條：①2016年8月至2018年6月復旦大學附屬兒科醫院(我院)納入新生兒基因組計劃的(ClinicalTrials.gov注冊號: NCT02551081)、臨床表現疑似IMD的高危兒；②患兒監護人對質譜檢測和NGS篩查IMD簽署書面知情同意書。

1.3 檢測人群排除標準 符合以下任意1條：①具有特殊面容的患兒；②影像學檢查發現神經、心血管、消化、或泌尿生殖系統存在明確結構畸形；③住院時間<12 h即自動出院或死亡。

1.4 目的基因捕獲的NGS及陽性結果分類

1.4.1 檢測方法 選用Agilent ClearSeq Inherited Disease試劑盒(包含2 742個已知致病基因)。測序實驗采用Illumina Hiseq 平臺，與人類參考基因組序列比對，98%的目標捕獲區域測序深度大于20×。變異采用VEP軟件(Variant Effect Predictor, Ensembl 73)進行注釋。3個主要的收錄已知或疑似致病變異的數據庫ClinVar、OMIM和HGMD用于篩選已知的致病變異，同時采用多種工具預測預測錯義變異的危害性、注釋非編碼區序列等。基于人群的大規模測序數據庫用于排除在正常人群中具有較高頻率的變異。變異使用Clinic Sequence Analyzer(CSA，WuXi NextCODE)進行評估，并依據美國醫學遺傳學與基因組學學會(ACMG)發布的《序列變異解讀標準和指南》對每個變異進行分類。變異按照人類基因組變異協會(HGVS)規則進行命名。陽性變異采用Sanger測序進行驗證。

1.4.2 基因檢測陽性病例分類 樣本基因檢測數據分析由我院分子診斷中心經驗豐富的臨床信息分析人員完成后，與臨床醫生共同確定樣本的最終分子遺傳學診斷[4, 5]。將基因檢測陽性病例分為IMD和非IMD的遺傳性疾病。

1.5 質譜檢測及異常判斷

1.5.1 血氨基酸、酰基肉堿譜和尿有機酸譜檢測 用一次性采血針采集患兒手指或足跟的末梢血，滴于專用采血濾紙片上，經含有氨基酸和酰基肉堿內標的有機溶劑萃取、鹽酸正丁醇衍生后，用LC-MS/MS儀進行血氨基酸和酰基肉堿譜分析。同時留取患兒清潔尿標本，經肌酐含量測定校正和鹽酸羥胺、氫氧化鈉、鹽酸處理，加入內標并經有機溶劑萃取、甲基硅烷化衍生后，用GC-MS儀進行尿有機酸譜分析。質譜檢測結果由我院質譜室專業技術人員，根據患兒血、尿代謝譜的變化，結合患兒臨床資料分析判斷，將質譜檢測異常結果分為提示IMD可能和提示繼發性改變可能。遺傳代謝病的特異性代謝標志物見表1。

1.5.2 質譜檢測可篩查的IMD疾病譜 見表2。

1.6 金標準、待測標準檢測和報告時間 同時采集IMD高危兒血和尿，行質譜和NGS檢測。質譜檢測結果1周內獲得，NGS診斷周期3周左右。

1.7 臨床信息采集 本研究的目的是比較NGS和質譜檢測對遺傳代謝病的篩查效能，故非IMD不在本文進一步討論。故僅收集基因檢測診斷為IMD患兒的人口學信息(性別、檢測年齡、家族史)，臨床癥狀與體征，其他實驗室輔助檢測(血氨、血糖、血乳酸等)，確診后患兒臨床診療方案的改變情況，并電話隨訪IMD患兒的近期結局。

1.8 統計學方法采用SPSS 22.0進行統計學分析。以NGS結果為金標準，根據四格表計算質譜檢測結果診斷IMD的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及其95%CI。

表1 遺傳代謝病的特異性代謝標志物

注 Phe：苯丙氨酸；Tyr：酪氨酸；Leu：亮氨酸；Val：纈氨酸；Met：蛋氨酸；Cit:瓜氨酸；Arg：精氨酸；Orn：鳥氨酸；Gly：甘氨酸；GAA：胍基乙酸；Cr：肌酸；Pro：脯氨酸；Lys：賴氨酸；His：組氨酸；Xle：氧代脯氨酸；C0：游離肉堿；C16：棕櫚酰肉堿；C18：硬酯酰肉堿；C18:1：硬酯烯酰肉堿；C4：丁酰肉堿；C3：丙酰肉堿；C4-OH：羥基丁酰肉堿；C8：辛酰肉堿；C10：癸酰肉堿；C14-OH：羥十四酰肉堿；C16-OH：羥棕櫚酰肉堿；C18-OH：羥硬酯酰肉堿；C14:1：十四烯酰肉堿；C14：十四酰肉堿；C10:2：癸二烯肉堿；C2：乙酰肉堿；C3DC：丙二酰肉堿；C5：戊/異戊酰肉堿；C5DC：戊二酰肉堿；C5:1：戊烯酰肉堿；C5-OH：羥戊酰肉堿；C6DC：己二酰肉堿

表2 質譜檢測可篩查的遺傳代謝病疾病譜

2 結果

2.1 一般情況 符合本文納入和排除標準的2 000例IMD高危新生兒進入本文分析，男1 131例(56.6%)，女869例。早產兒670例(33.5%)。神經系統主要表現為意識改變、驚厥發作和肌張力異常(增高或降低)594例(29.7%)；呼吸系統主要表現為不明原因的呼吸困難和反復發紺818例(40.9%)；消化系統主要表現為反復嘔吐、持續黃疸、肝功能異常和體重增長不滿意858例(42.9%)；代謝和電解質系統主要表現為持續低血糖、嚴重代謝性酸中毒、高血氨、電解質紊亂和高乳酸血癥382例(19.1%)；循環系統和感染主要表現為不明原因休克、嚴重持續感染814例(40.7%)。

2.2 NGS結果 2 000例IMD高危新生兒中NGS檢測到明確致病變異的病例217例(10.9%)，其中IMD 33例(1.7%)，非IMD 184例。33例IMD中，錯義變異32個，無義變異8個，移碼變異12個，剪切位點變異5個，片段雜合缺失2個。其中收錄在HGMD數據庫中的變異有27個。

2.3 質譜檢測結果 2 000例IMD高危新生兒中質譜結果異常154例(7.7%)，提示繼發性改變可能128例，提示IMD可能26例。提示IMD可能的26例中，有機酸代謝病11例、氨基酸代謝病9例、脂肪酸代謝病6例。

表3顯示，以NGS檢測結果為金標準，質譜檢測待測標準1(提示IMD可能+提示繼發性改變可能)為陽性結果，質譜檢測的敏感度93.9%(95%CI：79.8%～99.3%)，特異度93.8%(95%CI：92.6%～94.8%)，陽性預測值20.1%(95%CI：17.2%～23.4%)，陰性預測值99.9%(95%CI：99.6%～100%)。以質譜檢測待測標準2(提示IMD可能)為陽性結果，質譜檢測的敏感度78.8%(95%CI：61.1%～91.0%)，特異度100%(95%CI：99.8%～100%)，陽性預測值100%，陰性預測值為99.7%(95%CI：99.3%～99.8%)。

2.4 質譜檢測與NGS結果比較

表3 2 000例IMD高危兒NGS和質譜檢測篩查四格表

注 待測標準1：質譜提示IMD可能+提示繼發性改變可能，待測標準2：質譜提示IMD可能

2.4.2 質譜檢測待測標準1中，假陰性2例 質譜結果正常的1 846例中，NGS發現2例IMD。例1：男嬰，年齡14 d，因“納奶差伴反應欠佳1 d”于我院就診，查體：四肢肌張力低下，患兒生后因“低血糖、黃疸”在外院治療。臨床考慮IMD可能，質譜檢測結果正常，NGS發現UPB1基因有致病/可疑致病變異，變異位點c.91G>A(p.G31S)和c.977G>A(p.R326Q)，診斷β-脲基丙酸酶缺乏癥(OMIM 613161)，該病屬于嘧啶代謝異常，影響嘧啶分解代謝，尿液中可出現脲基丙酸鹽、脲基異丁酸鹽異常升高。例2：男嬰，4 d，因“皮膚黃染3 d，青紫1次”于我院就診，生化檢查提示代謝性酸中毒和高膽紅素血癥，臨床考慮IMD可能，質譜檢測結果正常，NGS發現MOCS1基因有致病/可疑致病變異，變異位點c.199C>T(p.R67W)和c.45delG(p.A17Qfs*79)，診斷鉬輔因子缺乏癥A型(OMIM 252150)，因影響鉬輔因子依賴的酶類活性，而導致嘌呤、硫等代謝障礙，可出現血清尿酸水平降低及尿液中亞硫酸鹽水平升高。值得說明的是，這2種疾病不包含在本文質譜檢測的病種中。

2.5 NGS確診IMD患兒的臨床特征 NGS診斷IMD 33例，男性19例，女性14例，NGS檢測時年齡1～33 d。確診為21種IMD，有機酸代謝異常8種15例(45.5%)、氨基酸代謝異常7種9例(27.3%)、脂肪酸氧化代謝異常3種6例(18.2%)，其他類型IMD共3例(9%)。患兒主要臨床表現，消化系統：納差、拒奶、嘔吐，呼吸系統：呼吸暫停、呼吸困難，神經系統：反應欠佳、驚厥發作、四肢肌張力異常；實驗室檢查以代謝性酸中毒、血氨水平升高和低血糖為主。患兒家族史中曾有同胞因相似臨床表現或不明原因導致新生兒期死亡，和(或)伴有其母不明原因自然流產或死胎等12例(36.4%)。

3 討論

新生兒期發病的IMD病情危重，臨床表現缺乏特異性，難以及時診斷和干預，是新生兒死亡的主要原因之一[6, 7]。MS/MS能對血樣本中多種氨基酸和酰基肉堿進行快速定量檢測。美國率先應用串聯質譜技術進行新生兒疾病篩查[8]。我國由上海兒科研究所于2002年開展串聯質譜技術的新生兒疾病篩查，截至目前，國內近80個實驗室開展了新生兒IMD篩查。但因各地區社會特征、疾病研究背景、經濟狀況的不同，篩查的IMD疾病種類從幾種到幾十種不等[9]。我院結合血液相色譜-串聯質譜和尿氣相色譜-質譜技術對51種IMD進行篩查，通過與NGS測序結果的比較發現，有5/33例(15.2%)NGS檢測出的代謝性疾病未包含在質譜篩查的疾病譜中，故仍需不斷完善質譜檢測的IMD疾病譜，以便在尚不能進行基因檢測的地區完善質譜篩查。

并不是所有的遺傳代謝病均會在新生兒期起病。但是對于這類疾病，如能早期診斷，在發病前進行正規的評估隨診，避免誘發因素，可延緩發病，在出現癥狀時能及時針對性治療，能改善預后。本研究中，質譜檢測范圍內有2例患兒提示為繼發性改變可能，但NGS檢測到IMD的致病/可疑致病變異。者2例分別診斷為5-羥脯氨酸酶缺乏癥和希特林缺乏所致新生兒肝內膽汁淤積癥。這2種疾病，均可在新生兒期無明顯臨床表現，早期質譜篩查可無明確異常。但是，如早期診斷，可以有針對性地進行隨訪和定期的評估，從而改善患兒的長期預后。目前國內外關于5-羥脯氨酸酶缺乏癥病例報告十分有限，對于該病的診斷和長期隨訪可豐富該病臨床表型，加深認識[10]。對于希特林缺乏所致新生兒肝內膽汁淤積癥患兒，通過飲食調整及對癥治療，可能改善預后[11]。

由于人體代謝途徑為一極其復雜的網絡，許多代謝途徑相互交叉，質譜結果易受患兒飲食、病情、治療和檢測時間等因素的影響，特別是對于許多代謝途徑并不旺盛的新生兒，某些IMD特異性的代謝物水平可能無明顯升高[2]。在本研究中，2/33例患兒(6.1%)通過NGS測序糾正了質譜檢測的結果。1例為MEGDEL綜合征，又稱3-甲基戊烯二酸尿癥Ⅳ型。該病患兒體內3-甲基戊烯二酸水平變化程度極大。而研究中患兒代謝紊亂表現與該病導致磷脂重塑缺陷而繼發線粒體功能障礙，從而影響體內其他物質在線粒體中的代謝過程有關。1例為鳥氨酸氨甲酰基轉移酶缺乏癥,該患兒臨床表現較重，合并驚厥、低血糖及肝功能受損表現，可能出現繼發的代謝紊亂，從而造成結果判讀的困難。本研究中，有11/33例患兒(33.3%)通過NGS測序細化了疾病類型，這對于此類疾病的針對病因的精準治療，也是至關重要的。

目前廣泛用于臨床檢測的全外顯子組測序、臨床外顯子組測序，因其涵蓋疾病譜廣、不依賴于典型的臨床表現，使得很多的新生兒期遺傳相關疾病得到了早期的診斷。需要指出的是，這類檢測是針對于編碼區及剪接位點，較深的內含子的致病變異并不在其捕獲范圍之內。此外，對于基因內的缺失，也不是所有的檢測機構都能通過數據分析的完善而進行識別。例如，本研究中所提及的希特林缺乏所致新生兒肝內膽汁淤積癥患兒包含1個SLC25A13基因內的0.2 kb的缺失，我院的NGS數據分析流程在升級后可以進行此類拷貝數水平的檢測和注釋[5]，但是常規的NGS分析方法可能會漏掉這類變異的發現。故而，在這種情況下，雖然NGS檢測疾病譜遠大于質譜檢測，但是對于代謝性疾病，從DNA水平及代謝物水平進行綜合評估，才能最大程度地提高診斷的準確性。

本文的不足：①本文未將串聯質譜檢測范圍外的代謝性疾病，如糖原累積病、過氧化物酶體病等，列入IMD疾病進行比較；②本文僅針對納入的2 000例高危新生兒中NGS診斷明確的患兒，進行了臨床及2種檢測結果的比較及分析；③本研究在單中心進行，結果可能存在地區的特異性。

綜上所述，本研究提出，需要進一步通過多中心大規模的流行病學調查，不斷完善IMD疾病譜，以此為依據在尚不能進行基因檢測的地區完善質譜篩查的檢測病種；在有條件的地區，需要將NGS和質譜檢測結合，在新生兒期對于臨床異質性高、表型錯綜復雜的代謝性疾病的高危兒進行更為積極的檢測及評估。