白細胞介素-1基因多態性與種植體周圍炎的相關性

趙祥宇，吳劉中，史春，盧永平，郭傳波

（1. 沈陽市口腔醫院修復科，沈陽 110002； 2. 沈陽市口腔醫院牙周科，沈陽 110002；3. 大連醫科大學附屬口腔醫學院口腔內科，遼寧 大連116044；4. 遼寧省計劃生育科學研究院優生遺傳科，沈陽 110031）

自從口腔種植體骨整合理論提出后，種植體材料不斷創新，種植技術日趨成熟，種植體的成功率也越來越高［1］。但是種植修復后的并發癥 （種植體周圍炎、種植體周圍黏膜炎、種植失敗） 仍然是種植醫師面臨的棘手問題。種植體周圍炎使種植體周圍軟組織和支撐骨組織功能喪失，是導致種植體松動失敗的主要原因［2］。近年來研究［3-4］結果表明，種植體周圍炎的發生不是均勻分布的，而是呈現聚集性，這種聚集現象的發生與遺傳異質性相關［5］。

種植體周圍炎與牙周炎的發病機制、臨床表現相似，有牙周炎病史會增加種植體周圍炎的患病風險［6］。研究［7］表明炎癥細胞因子的基因多態性影響患者牙周細菌感染的炎癥反應程度，也決定個體對牙周炎的易感性。牙周炎的發生與患者基因型相關，約50%以上牙周炎患者的病因是基因問題［8］。同樣地，炎癥細胞因子的基因多態性在種植體周圍炎的發生中也起重要作用［9］。

白細胞介素-1 （interleukin-1，IL-1） 是結締組織分解代謝的刺激劑，具有增強白細胞向組織遷移，激活成纖維細胞和免疫有核細胞的作用。 IL-1定位于2q13，包括IL-1 α、IL-1 β 和IL-1γn3種。這些基因的遺傳多態性影響基因產物的表達，進而影響炎癥的發生。有研究［10-11］報道IL-1多態性對種植體周圍炎的發生有重要作用。本研究通過對IL-1基因進行分型，分析基因多態性與種植體周圍炎發生的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象及分組

選取2008年9月至2015年9月沈陽市口腔醫院種植科行種植體義齒修復的患者 （203例）。納入標準：至少植入1顆及以上種植牙，并且完成修復時間1年及以上。根據患者有無種植體周圍炎分為PI組 （有種植體周圍炎，116例） 和NPI組 （無種植體周圍炎，87例）。分組標準［12］：種植體周圍探診出血，化膿以及骨損失≥2 mm為種植體周圍炎；無探診出血，化膿和骨損失<2 mm為無種植體周圍炎。PI組男47例，女69例，年齡32～64歲，平均年齡 （45.3±2.6）歲；牙周炎94例，無牙周炎22例；吸煙23例，不吸煙93例。NPI組男36例，女51例；年齡29～61歲，平均年齡 （43.2±3.4） 歲，牙周炎56例，無牙周炎31例；吸煙7例，不吸煙80例。2組患者性別、年齡比較差異無統計學意義 （χ2=0.015，P = 0.900；t = 0.68，P = 0.625），牙周炎、吸煙患者人數比較差異有統計學意義 （χ2分別為7.16、5.48，P分別為0.007、0.019）。所有患者均知情同意并簽署了知情同意書。

1.2 樣本采集和DNA提取

患者清水漱口后用無菌棉簽在雙側臉頰內部上下輕刷數次，使棉簽充分接觸口腔黏膜。取樣后放入裝有生理鹽水的離心管中保存。用口腔拭子基因組DNA提取試劑盒 （中國天根公司） 提取DNA，用 NanoDrop 1000 （美國 Thermo Fisher Scientific公司） 測定DNA濃度，用TE （10 mmol/L Tris，0.1 mmol/L EDTA，0.5mol/L NaCl） 統一標準化為50 ng/μ L。

1.3 IL-1基因多態性位點選擇及PCR擴增

在千人基因組官網 （http：//www.internationalgenome.org） 下載中國人群IL-1 α、IL-1 β 和IL-1γn的單核苷酸多態性 （single nucleotide polymorphism，SNP）位點信息，用Haploview 4.2 （https：//www.broadinstitute.org/haploview/haploview） 進行分析，以MAF>0.1，r2>0.8進行tagger分析， 分別選擇rs2856838、 rs3136558、 rs4252001作為IL-1 α，IL-1 β和IL-1γn的標記 SNP進行基因分型，見圖1。采用聚合酶鏈反應-限制性內切酶片段長度多態性分析方法 （polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP） 進行基因分型。PCR反應體系：DNA 1 μ L，2×Taq PCR MasterMix 10 μ L，正、反義引物 （10 nmol/L） 各0.6 μ L，無菌去離子水補足至20 μ L。PCR擴增程序：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保持。各基因PCR引物、內切酶及片段長度見表1。

1.4 限制性酶切及電泳

PCR完成后，取2.5 μ L擴增產物，分別加入相應的內切酶 （2 U），加入10×CutSmart Buffer 1 μ L，去離子水補足至10 μ L。37 ℃反應2 h，取5 μ L酶切產物進行電泳，根據電泳條帶進行基因分型。

圖1 Haploview軟件對IL-1 α、IL-1 β、IL-1γn進行標記 SNP分析結果Fig.1 Tagged SNP results for IL-1 α，IL-1 β，and IL-1γn analyzed by Haploview

表1 各基因PCR引物、內切酶及酶切片段長度Tab.1 Primer，endonucleases，and length of products of each gene

1.5 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件對各SNP位點進行統計分析，2組間的基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-1 α、IL-1 β 和IL-1γn的SNP酶切結果

結果顯示，IL-1 α基因rs2856838經HpyCH4Ⅳ酶切后，GG基因型為92 bp和115 bp 2條帶，純合型AA為207 bp 1條帶，而雜合型GA為3條帶。IL-1 β基因rs3136558經DpnⅡ酶切后，TT基因型為35 bp 、170 bp 2條帶，純合型CC為205 bp 1條帶，雜合型CT基因型為3條帶。IL-1γn基因rs4252001經PsiⅠ酶切后，AA基因型為27 bp和206 bp 2條帶，純合型GG為233 bp 1條帶，雜合性AG為3條帶。見圖2。

2.2 2組基因型分布比較

圖2 多態位點酶切后電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of SNP

結果顯示，IL-1 α 基因rs2856838位點中，與GG基因型比較，AA基因型PI組與NPI組中分布有統計學差異 （P < 0.05），GA基因型2組分布無統計學差異 （P > 0.05）。IL-1 β基因 rs3136558和IL-1γn基因rs4252001位點各等位基因型分布均無統計學差異（均P > 0.05）。見表2。

3 討論

種植體周圍炎能使支持骨喪失，形成種植體周圍深牙周袋，從而導致種植失敗。2008年第6屆歐洲牙周病學術研討會［13］明確口腔衛生差、牙周炎病史和吸煙是種植體周圍炎的風險因素，這在本研究中得到了證實。近年來研究［14］表明，微生物、遺傳因素等對種植體周圍炎的發生也至關重要。微生物和遺傳易感性是種植患者發生種植體周圍炎風險更高的原因［15］。

IL-1基因多態性作為種植體周圍炎的危險因素越來越受到研究者的重視。雖然LACHMANN等［16］研究未能發現IL-1基因型與種植體周圍炎之間存在相關性，但是越來越多研究發現IL-1基因與種植體周圍炎發生相關。有學者通過meta分析發現IL-1 α和IL-1 β 復合基因型是植入失敗和種植體周圍炎的危險因素［17］，HAMDY 等［18］通過病例對照研究發現IL-1基因型在種植體周圍炎組與非種植體周圍炎組間有統計學差異。以往研究［9，18］大多集中在IL-1 α-899C>T、IL-1 β +3954C>T位點上。IL-1α-899C>T和IL-1 β +3954C>T位點在亞洲 （特別是中國） 人群中最小等位基因頻率較低 （分別為0.09和0.03）。本研究通過生物信息學方法，選擇了基因頻率較高的3個標簽SNP位點來進行組間基因型頻率和等位基因頻率分析，以此來研究IL-1基因在種植體周圍炎的發生中的作用。

本研究發現IL-1 α 基因rs2856838位點為AA基因型比GG基因型發生種植體牙周炎的風險高3.34倍，與以往研究［9，19-20］結果相同，驗證了IL-1 α 基因在種植體周圍炎發生中起重要作用。然而未發現IL-1 β 和IL-1γn基因的基因型與種植體周圍炎發生具有相關性 （P > 0.05）。這可能與本研究納入樣品數少有關。另外，本研究發現吸煙患者與不吸煙患者比較更容易發生種植體周圍炎，進一步證實吸煙影響種植體周圍炎的發生。

表2 PI組和NPI組基因型分布比較Tab.2 Genotype distribution of PI group and NPI group

綜上所述，IL-1參與種植體周圍炎的發生過程，IL-1 α 基因rs2856838的AA基因型與種植體周圍炎的發生具有相關性。本研究探討了IL-1基因多態性與種植體周圍炎的相關性，由于樣本數量較少，目前對于遺傳異質性以及不同環境因素影響等方面的研究較少，因此，有必要開展多中心聯合研究，擴大樣本量，對基因多態性、環境因素與種植體周圍炎的關系進行深入研究。