miR-362-3p在喉癌組織中的表達及其對喉癌Hep-2細胞遷移的影響

趙越，孫媛媛，佟雪，岳鵬杰，富偉能

（中國醫科大學基礎醫學院遺傳學教研室，沈陽 110122）

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，以鱗狀細胞癌為主［1］。雖然治療手段不斷進步，但是喉癌患者的總生存率仍未提高［2］，侵襲轉移是喉癌的主要死因［3］。因此，研究喉癌發生發展的分子機制有助于發現喉癌診治和預后判定的分子標志物，具有重要的潛在臨床意義。微小RNA （microRNA，miRNA）是一種內源性非編碼小RNA，參與多種腫瘤的發生發展，因其在人體多種體液中穩定表達可望成為多種疾病的分子標志物［4］。前期工作［5］表明，miR-362-3p是MYCT1基因的下游調控基因。miR-362-3p在腎細胞癌［6］、乳腺癌［7］、血管平滑肌細胞［8］、滋養層細胞［9］和胃癌細胞［10］的遷移和侵襲中發揮重要作用。然而，miR-362-3p在喉癌中的作用和機制研究未見報道。本研究擬通過分子生物學技術檢測miR-362-3p在喉癌組織中表達水平及其對喉癌細胞遷移能力的影響，為進一步研究miR-362-3p在喉癌中的作用和分子機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本收集：50例喉癌及癌旁正常組織標本取自解放軍第463醫院耳鼻喉科，手術后立即置于-80℃深凍冰箱中保存備用，其中，42例標本具有完整臨床資料信息，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。術后標本均經病理學檢查確診，本項目研究經中國醫科大學倫理委員會批準。

1.1.2 細胞株：人喉癌Hep-2細胞購自中科院上海細胞所。

1.1.3 試劑：Trizol試劑、miRNA逆轉錄試劑盒、實時PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司， Poly plus轉染試劑購自法國Afao公司，8.0 μ m 孔徑 Transwell 小室購自美國Coster公司。

1.2 方法

1.2.1 實時PCR檢測：應用Trizol試劑提取細胞和組織總RNA，應用miRNA反轉錄試劑盒反轉miRNA為cDNA，反轉錄條件為37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。以U6作為內參，應用實時PCR檢測miR-362-3p表達水平。miR-362-3p模擬物、抑制劑和陰性對照microRNA由武漢金開瑞生物工程公司合成，主要引物序列：U6，F，5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’； R，5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3。 miR-362-3p，5’-AACACACCTATTCAAGATTCA-3’。通用下游引物，5’- CGAATTCTAGAGCTCGAGGCAGGCGACAT GGCTGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATC CACTAGTCC （T） 25VN-3。

1.2.2 細胞轉染：喉癌Hep-2細胞以2.5×105/孔密度種于6孔板中，培養過夜至細胞匯合度約為70%。根據Poly plus轉染試劑說明書操作，將miR-362-3p模擬物、抑制劑和陰性對照microRNA轉染Hep-2細胞，4～6 h后更換培養基。48 h后提取細胞RNA，應用實時 PCR檢測miR-362-3p表達水平。

1.2.3 細胞劃痕愈合實驗：應用200 μ L槍頭在轉染后的6孔板各孔直徑處劃過，顯微鏡下觀察并拍照。繼續培養細胞，分別在24 h、48 h顯微鏡下測量遷移距離并拍照，統計分析細胞遷移距離。

1.2.4 Transwell遷移小室實驗：0.25%胰酶消化轉染后的細胞，收集細胞沉淀并用雙無培養基重懸細胞。在上層小室中加入2×104個細胞，下室加入600 μ L正常培養基。培養24 h后，依次用4%多聚甲醛固定，蘇木素染色1 min、伊紅染色2 min、蘇木素復染1 min，用刀片切下膜，中性樹膠封片。顯微鏡下隨機選取5個視野計數細胞并拍照，5個視野平均數作為每個小室的細胞數。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 miR-362-3p在喉癌中表達水平的檢測結果

以U6為對照，應用實時PCR檢測50例喉癌和癌旁正常組織中miR-362-3p表達水平，結果表明，66%（33/50） 喉癌組織中miR-362-3p表達水平 （8.84±21.42）較癌旁正常組織 （1.76±3.03）升高，差異具有統計學意義 （t = 2.316，P = 0.025）。

2.2 miR-362-3p在喉癌組織中表達水平與臨床病理特征的關系

結果表明，miR-362-3p與淋巴結轉移和喉癌臨床分期密切相關 （均P < 0.05），而與患者性別、年齡、分化等因素不相關 （均P > 0.05），見表1。

2.3 miR-362-3p對喉癌Hep-2細胞遷移能力的影響

表1 miR-362-3p的表達水平與臨床病理特征的關系Tab.1 Relationship between miR-362-3p expression and clinicopathological parameters of laryngeal cancer patients

實時 PCR結果顯示，miR-362-3p模擬物組 （73.33±48.39） 和抑制物組 （0.38±0.11） 與陰性對照microRNA組 （NC組，1.00±0.00） 比較，喉癌Hep-2細胞中miR-362-3p表達水平分別顯著升高和降低 （均P < 0.05），提示轉染成功。劃痕愈合實驗結果顯示，miR-362-3p模擬物組細胞遷移距離顯著大于NC組，而miR-362-3p抑制劑組遷移距離顯著小于NC組 （均P < 0.05），見表2、圖1A；Transwell實驗結果顯示，miR-362-3p 模擬物組遷移細胞數量顯著高于NC組，而miR-362-3p 抑制劑組遷移細胞數目顯著少于NC組 （均P < 0.05），見表2、圖1B。

表2 各組Hep-2細胞遷移距離和遷移細胞數比較Tab.2 Analysis of Hep-2 cell migration distance and numbers according to transfection

圖1 miR-362-3p對喉癌細胞遷移能力的影響Fig.1 Effects of miR-362-3p on Hep-2 cell migration

3 討論

miR-362是重要微小非編碼RNA，在腫瘤的發生發展中發揮重要作用。miR-362在不同腫瘤中作用不同，提示其具有組織特異性。miR-362-3p在腎癌和乳腺癌中發揮抑癌基因作用［6-7］，而在胃癌和肝癌中發揮癌基因作用［10-12］。

本研究發現miR-362-3p在喉癌組織中高表達，臨床病理特征分析結果顯示miR-362-3p在喉癌組織中的表達水平與淋巴結轉移和臨床分期有關。同時，miR-362-3p促進喉癌細胞遷移，提示其在喉癌中發揮潛在癌基因作用。與本研究結果相似，以往研究［10-13］表明miR-362-3p在胃癌、肝癌和結腸癌中高表達，促進胃癌細胞的遷移。而與本研究結果相反，以往研究［6-7］表明，miR-362-3p在腎癌和乳腺癌中低表達并抑制腎癌和乳腺癌細胞的遷移。除腫瘤外，低氧條件下miR-362-3p抑制滋養層細胞的侵襲和轉移［9］；miR-362-3p在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者血液中低表達，并抑制血管平滑肌細胞遷移［8］。

眾所周知，miRNA通過抑制或降解靶基因mRNA發揮生物學功能。miR-362-3p通過靶向CD82促進胃癌細胞上皮間質轉化［10］。在腎細胞癌中miR-362-3p表達下調并靶向nemo樣激酶抑制腫瘤細胞侵襲［6，14］。在其他疾病中miR-362-3p通過靶向ADAMTS1抑制血管平滑肌細胞的遷移［8］；miR-362-3p靶向Pax3抑制滋養層細胞的增殖、遷移和侵襲［9］。然而，miR-362-3p通過哪些靶基因促進喉癌細胞的遷移作用需進一步研究證實。

綜上所述，miR-362-3p在喉癌組織中表達上調，促進喉癌細胞遷移，提示其在喉癌發生中發揮潛在癌基因作用，本研究為進一步探討miR-362-3p表達在喉癌細胞遷移的分子機制提供了重要線索。