浙麥冬根際及非根際細菌菌群結構與多樣性研究

陳 宸 石森林（指導）

浙江中醫藥大學 浙江 杭州 310053

本研究以慈溪和桐廬兩個產地浙麥冬為研究對象，通過高通量測序手段研究浙麥冬根際與非根際土壤微生物的結構與多樣性差異，為浙麥冬根際微生態的研究提供基礎數據，同時為進一步研究浙麥冬對根際微生態的影響機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本采集：于2018年9月在慈溪（CX）和桐廬（TL）浙麥冬產區進行樣品采集，在二年生浙麥冬種植區域均勻選取3個采樣點，每個采樣點通過五點取樣法采集樣本。將浙麥冬植株連根拔起，抖落根系外圍的大塊土壤，利用1L磷酸緩沖液清洗得到粘附在根部的土壤作為根際土壤（G），在植株附近無植物生長的地方取20cm深處土壤作為非根際土壤（FG），將從兩個產區采集到的各兩種土壤樣本分別標記為：慈溪根際土壤（CXG）、慈溪非根際土壤（CXFG）、桐廬根際土壤（TLG）和桐廬非根際土壤（TLFG）。將同類樣本混合均勻，使用qigen DNAeasy powerSoil kit試劑盒（qigen公司，美國）按說明書提取獲得DNA，使用Nanodrop2000紫外分光光度計檢測濃度，通過瓊脂糖凝膠電泳分析DNA完整性。

1.2 16SrDNA基因擴增及Ion Torrent S5測序：采用引物341F/806R(341F：CCTAYGGGRBGCASCAG；806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT)擴增16SrDNA V3-V4可變區片段。PCR擴增程序如下：95℃for 3 minutes；35cycles of：-95℃ for 30 seconds；-58℃ for 30 seconds；-72℃ for 30 seconds；-72℃for 5 minutes；獲得的PCR產物進行磁珠篩選純化，得到PCR產物。將每個樣品等比例混合后，依托Thermo Fisher Scientific公司Ion Torrent S5平臺進行測序（由浙江天科高新技術發展有限有限公司提供）。

1.3 數據分析：測序得到的raw data，通過生物信息分析去除接頭和barcode序列；然后使用QIIME軟件對數據進行過濾，過濾掉含N較多或者低質量序列，最后進行嵌合體過濾，得到可用于后續分析的有效數據（序列平均長度在420bp左右），利用Uparse軟件對所有樣品的全部Effective Tags進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，同時會選取OTUs的代表性序列，依據其算法原則，篩選的是OTUs中出現頻數最高的序列作為OTUs的代表序列。對OTUs代表序列進行物種注釋，用uclust方法與Silva數據庫進行物種注釋分析，并分別在各個分類水平：kingdom（界），phylum（門），class（綱），order（目），family（科），genus（屬），species（種）統計各樣本的群落組成。使用PyNAST軟件與Silva數據庫中的“Core Set”數據信息進行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統發生關系。最后對各樣品的數據進行均一化處理，以樣品中數據量最少的為標準進行均一化處理，后續的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數據。使用QIIME 軟件計算 Observed-species，Chao1，Shannon，Simpson，ACE，Goods-coverage指數，使用R軟件進行Alpha多樣性指數組間差異分析；Alpha多樣性指數組間差異分析選用T-test檢驗。

2 結果

2.1 根際與非根際土壤細菌多樣性指數比較：將4種土壤樣本的Effective Tags進行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為OTUs。對OTU數量進行比較，未發現顯著差異。通過Shannon指數、Simpson指數、ACE指數和Chao1指數比較不同土壤微生物Alpha多樣性，無顯著差異。詳見表1。

表1 四種土壤樣本細菌多樣性指數

表2 CXG與CXFG的Fisher樣本間物種差異分析

表3 TLG與TLFG的Fisher樣本間物種差異分析

圖1 門水平上的物種相對豐度柱形圖

2.2 細菌群落組成及多樣性分析：CXG、CXFG、TLG、TLFG四種土壤分別有27、27、24和27個門類菌群。根據物種注釋結果，四種土壤中豐度最大的十個門類相同，分別是：Proteobacteria（變形菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Acidobacteria（酸桿菌門）、Gemmatimonadetes（芽單胞菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Chloroflexi（綠彎菌門）、Patescibacteria、Latescibacteria、Cyanobacteria（藍藻門）和Nitrospirae（硝化螺旋菌門）。從圖1可以看出，Proteobacteria（變形菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Patescibacteria和Cyanobacteria（藍藻門）在根際土壤中的相對豐度明顯高于在非根際土壤中，而Acidobacteria（酸桿菌門）和Actinobacteria（放線菌門）的相對豐度在兩者間基本持平，Gemmatimonadetes（芽單胞菌門）、Chloroflexi（綠彎菌門）、LatescibacteriaNitrospirae（硝化螺旋菌門）在非根際土壤中的相對豐度則明顯高于在根際土壤中。

2.3 細菌群落結構差異分析：將4種土壤樣本的OTU分布進行Venn圖分析，4種土壤中均有分布的OTU數量為600，TLG與TLFG共有OTU數量為1093，CXG與CXFG共有OTU數量為967，TLG與CXG共有OTU數量為827，TLFG與CXFG共有OUT數量為903，4種土壤依獨有OUT數量由高到低次序為：CXFG（155）、TLG（117），TLFG（93），CXG（68）。在屬分類水平上對四種土壤樣本進行CXG與CXFG、TLG與TLFG樣本間Fisher檢驗，找出差異顯著的物種。在CXG與CXFG可鑒定到屬的266個屬中有顯著差異的（P＜0.05）有147個，在TLG與TLFG可鑒定到屬的254個屬中有顯著差異的（P＜0.05）有112個。取差異最顯著的前10個屬展示，見表2、表3。

3 討論

麥冬作為重要的常用中藥材，最早在《神農本草經》中就有記載，曰其“氣味甘、平，無毒”“久服輕身不老，不饑”。有臨床報道，沙參麥冬湯能夠延長非小細胞肺癌患者無進展生存期，并能顯著改善患者生活質量[1]。而麥冬的藥效往往與其產地有關。植物通過根系向土壤分泌有機物質影響土壤微生物，受到這種影響的土壤區域稱為根際。以往研究表明，在麥冬生長期間，麥冬根系向根外不斷分泌有機物質，這些有機物質對根際土壤微生物的物種結構會產生影響[2]。而根際土壤微生物的結構變化反過來會對土壤肥力和植物生長產生重要影響[3]。本研究發現，根際土壤細菌與非根際土壤細菌在門和屬水平上結構存在明顯差異，特別是屬水平上物種差異明顯。麥冬根系對黃桿菌屬、假單胞桿菌屬、不動細菌屬、亞桿菌屬和腸桿菌屬這些反硝化細菌有明顯選擇性，與水稻情況基本相似[4]。值得注意的是，慈溪與桐廬兩地非根際土壤可能因受自然條件、土壤理化性質的影響，細菌物種數量和群落結構有明顯差異，但兩地根際土壤根際土壤細菌物種數量和群落結構明顯趨近。這表明浙麥冬根系分泌物對根際土壤細菌的種類和群落結構有明顯調控作用。