植物甾醇提純與檢測優化研究

許騰 陳文潔

摘 要：本試驗以植物甾醇保健品為原料，對混合植物甾醇進行提純精制，并探討優化提純方法。其結果表明：對以乙醇為提純溶劑，利用響應曲面法對提純工藝進行優化的結果為：料液比1：32.4，結晶溫度-9.42℃，養晶時間6.08h，得率66.20%。氣相色譜分析，四種甾醇單體含量分別為菜籽甾醇3.28%，菜油甾醇17.01%，豆甾醇23.59%，β-谷甾醇43.86%，總甾醇含量為87.75%。植物甾醇在各種有機溶劑中存在溶解度和吸附力等性質差異，同時，料液比、結晶時間和結晶溫度對混合植物甾醇得率有明顯影響。

關鍵詞：植物甾醇;提純;優化

中圖分類號：TQ914.1 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2019）02-0074-03

本試驗運用溶劑重結晶法對混合植物甾醇進行提純，并探討甲醇、乙醇和丙酮三種不同溶劑的料液比、結晶時間和結晶溫度對混合植物甾醇得率的影響，利用響應曲面法優化其提純工藝，同時氣相色譜分析。旨在提供植物甾醇提純與檢測分析試驗的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

試劑（均為分析純）名稱：甲醇、無水乙醇、丙酮以及丙酸酐;植物甾醇（市售保健品）。

試驗儀器：HH-6數顯恒溫水浴鍋;HERATHERM Oven烘箱;SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵;SOP電子天平;Elmasonic P超聲清洗器;7890B氣相色譜儀。

1.2 試驗設計

1.2.1 溶劑選擇和提純

考慮有機溶劑的安全性、性質差異及穩定性等因素，本試驗選用甲醇、乙醇和丙酮為植物甾醇溶劑進行提純。

1.2.2 重結晶工藝優化

準確稱取2.00g植物甾醇放置于250mL圓底燒瓶中加入溶劑，用電磁攪拌水浴回流使樣品完全溶解并趁熱過濾，冷卻靜置后真空減壓抽濾，置于34℃恒溫箱真空干燥、稱重，最后計算晶體得率。

采用響應曲面法（Response Surface Methodology，RSM）[3-4]對重結晶工藝優化。通過評估結晶溫度（℃），料液比（甾醇質量/溶劑體積，W/V），養晶時間（h）三個單因素對重結晶工藝的影響，進行三個因素五個水平中心組合的優化試驗。

1.2.3 氣相色譜分析

準確稱取2.00g植物甾醇，加入1%膽甾醇-吡啶溶液5.0mL、丙酸酐3.0mL，水浴攪拌回流（80℃），冷卻后經0.45μm膜過濾，并置于10mL容量瓶中待衍生化后進行氣相色譜分析。色譜柱：DB-5柱（30m×0.25nm×0.25μm）;FID（氫火焰離子檢測器），溫度300℃;載氣：高純N2，載氣流量75mL/min;進樣量1μL;試驗時，在色譜柱柱溫60℃保持2min后，以2℃/min的速度升至100℃，再保持2min后以5℃/min的速度升至270℃，空氣流量45mL/min，氫氣流量55mL/min，分流比20：1，進樣器溫度270℃。

2 結果與討論

2.1 有機溶劑對重結晶的影響

使用甲醇、乙醇、丙酮為溶劑，在相同養晶時間和料液比及水浴回流溫度的條件下，對植物甾醇重結晶提純，得到三類植物甾醇晶體。分析三種溶劑中的晶體形狀及得率，無水乙醇得率最高為63.98%，晶形呈白色針尖狀;丙酮次之得率為55.26%，晶形呈白色顆粒狀;甲醇得率最小僅為9.61%，因溶解度較小的緣故，其晶體呈絮狀，顏色淺黃。

2.2 單因素初步試驗結果

2.2.1 料液比對重結晶的影響

料液比是植物甾醇質量與溶劑體積的比值。當料液比增加，溶液過飽和度較低，晶體形狀較好，有利于提高晶體純度，但結晶速度會變慢，得率較低;當料液比降低，溶液過飽和度增大，擴散阻力增加，導致晶體易包藏母液，使得結晶純度不高。

植物甾醇得率在三種溶劑中隨料液比的下降而出現先上升后下降的過程，并在料液比1：30時達到最大值。無水乙醇溶液中晶體得率最高為69.75%，而丙酮中的最大晶體得率為68.48%，甲醇溶液最大晶體得率僅為17.48%，這是因為植物甾醇在甲醇中溶解度最小，結晶率不高。因此，后續試驗選擇料液比為1：30。

2.2.2 結晶溫度對重結晶的影響

提高結晶溫度有利于晶體擴散，在較高溫度下生長的晶體，由于結晶質點排斥外來雜質的能力增強，晶體質量好。但溫度過高會導致結晶母液的過飽和度下降，晶體不完全析出，得率下降。相反低溫時則晶體生長相對緩慢，雜質析出多，晶體質量受影響。

在三種溶劑中料液比和養晶時間相同條件下，不同結晶溫度對植物甾醇晶體影響。重結晶得率均隨結晶溫度的升高而降低，其中-10℃為最佳結晶溫度。

2.2.3 養晶時間對重結晶的影響

分別在2.0h，4.0h，6.0h，8.0h時，評價甾醇重結晶得率受養晶時間的影響。可發現養晶時間對晶體得率影響不大，在約4.0h后趨于平緩，最佳養晶時間為4.0h。

2.3 重結晶優化工藝結果

2.3.1 植物甾醇重結晶響應曲面試驗結果

基于單因素試驗結果，選定響應曲面試驗設計的純化條件為：料液比1：30、結晶溫度-10℃、養晶時間4.0h。以乙醇為例，參照Design Expert軟件的分析結果對植物甾醇重結晶工藝進行優化。

使用方差分析進行二次響應面回歸模型方程的有效性檢驗，如表1。可發現，該模型F值為39.14，y（P>F）<0.0001。模型的顯著性與y值相關，當y小于0.0500時表明模型影響是顯著的，當y值小于0.0100時表明模型影響極顯著，因此A、B、AB、BC對整個試驗的影響均為極顯著。

運用Design Expert軟件進行分析，得出最佳提純工藝：料液比1：32.6，養晶時間6.08h，結晶溫度-9.44℃，植物甾醇的重結晶得率為66.22%。

在具體操作中將應用響應面分析法優化后的工藝參數調整為：料液比1：30，養晶時間6.0h，結晶溫度-10℃。在此參數條件下進行3次乙醇重結晶試驗，得率為67.26%±0.73%，試驗結果與回歸方程的預測值吻合良好。這表明該模型可優化控制提純過程的工藝參數。

2.3.2 料液比與結晶溫度對重結晶得率的影響

依據回歸方程生成料液比與結晶溫度的響應曲面分析，得到當乙醇為溶劑時料液比與結晶溫度對重結晶得率。當結晶溫度確定時，重結晶得率將隨料液比增大而先增加（51.08%～64.26%），再逐漸下降（64.26%～59.51%）;當料液比確定時，得率隨結晶溫度升高而緩慢下降（51.08%～50.23%）。說明料液比與結晶溫度有相互作用。

2.3.3 料液比與養晶時間對重結晶得率的影響

根據回歸方程生成料液比和養晶時間的響應曲面分析，得到當乙醇為溶劑時料液比與結晶溫度對重結晶得率。當養晶時間確定時，重結晶得率隨料液比增加而先逐漸增大（48.75%～63.45%），再緩慢下降（63.45%～54.03%）;當料液比確定時，得率隨養晶時間的變化趨勢較為平緩（48.75%～51.88%），即養晶時間對得率影響小。說明料液比和結晶溫度有相互作用。

2.3.4 結晶溫度和養晶時間對重結晶得率的影響

根據回歸方程生成結晶溫度和養晶時間的響應曲面分析，得到當丙酮為溶劑時料液比與結晶溫度對重結晶得率。當結晶溫度確定時，植物甾醇的重結晶得率隨養晶時間的增加先增大后下降（58.43%～64.74%，64.74%～62.85%）;當養晶時間確定時，得率隨結晶溫度增加而逐漸降低（58.43%～57.08%）。說明料液比與結晶溫度有相互作用。

2.4 氣相色譜結果

采用標準樣品保留時間定性法，以膽甾醇為內標物，通過氣相色譜檢測混合植物甾醇樣品的出峰順序，依次為膽甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇。見圖1至3。

通過面積歸一法計算植物甾醇中各單體含量。以甲醇溶劑對植物甾醇提純時，菜籽甾醇含量最低，為1.87%，β-谷甾醇的含量最高，為35.66%，總甾醇含量為73.06%。以乙醇溶劑對植物甾醇提純時，四種單體含量從大到小依次為β-谷甾醇>豆甾醇>菜油甾醇>菜籽甾醇，同時總甾醇含量為87.76%。以丙酮為溶劑對植物甾醇提純時，豆甾醇和β-谷甾醇含量分別為30.02%和38.01%，較接近，同時總甾醇含量為84.91%。

基于氣相色譜分析結果，對甲醇、乙醇和丙酮三種溶劑對植物甾醇的提純效果進行對比。植物甾醇在甲醇中溶解度小，得率在三種溶劑中最低，不建議用甲醇進行提純;當以乙醇為提純溶劑時，各單體含量較均勻，β-谷甾醇含量最多;用丙酮提純后的植物甾醇純度也比較高，但會有豆甾醇富集，使得各甾醇單體比例發生變化，如果要使提純后產品與原料中甾醇組成比例相近，最好不用丙酮為重結晶溶劑。

比較植物甾醇晶體形狀發現，晶形粘稠度、聚合度與豆甾醇含量相關，形狀差異與β-谷甾醇的含量有關。用甲醇提純后，晶體呈粘稠狀結塊，晶形不明顯，因為甲醇提純的β-谷甾醇最少。用丙酮提純后，晶體粘稠度低、聚合度高，晶形完整，因為丙酮提純的β-谷甾醇含量較低。使用乙醇提純后的晶體呈透明細長針形，因為其中β-谷甾醇含量較高。

3 結語

（1）使用溶劑提純得率的高低依次是乙醇，丙酮，甲醇。以乙醇為溶劑，最佳提純工藝為：料液比1：32.6，結晶溫度-9.44℃，養晶時間6.08h，重結晶得率為66.22%;通過Box-Behnken響應設計法分析，植物甾醇和乙醇的料液比（A）、結晶溫度（B）及養晶時間（C）對響應值的多元二次響應面回歸模型方程為：Y=64.94+2.17A-1.98B+0.49C-9.71 A2-0.86B2-3.42C2-0.17AB-0.72AC+0.27BC。（2）氣相色譜分析，植物甾醇出峰時間的先后順序依次為菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇。乙醇溶劑的提純效果最好，四種甾醇單體含量為菜籽甾醇3.29%、菜油甾醇17.03%、豆甾醇23.59%、β-谷甾醇43.88%，總甾醇含量為87.77%。

參考文獻

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