五味子木脂素對睡眠剝奪大鼠負性情緒及行為的影響

黃莉莉，耿一玄，閆金銘，王琪，王艷艷

（黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江哈爾濱150040）

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill的干燥成熟果實，民間多以煎煮口服、泡酒飲用、磨粉溫水口服為用，具有安神定志的功效。社會經濟飛速發展的今天，由于生活及工作的需求和壓力，越來越多的人處于潛在的睡眠剝奪狀態之中，長時間的睡眠剝奪會造成日間活動功能下降[1-3]。研究顯示，近一半的失眠患者都會伴有一種或幾種精神障礙，其中焦慮障礙占大約24%，抑郁障礙占大約23%[4]，包括由于失眠所導致的疲勞、體力下降等，這些都會對患者的身心健康及生活質量造成不可預估的巨大影響。因此，開發研究治療失眠的藥物或保健食品，除關注夜間睡眠質量以外，還應關注對焦慮、抑郁等負性情緒和抗疲勞能力等日間功能的改善作用。以往實驗研究表明，五味子木脂素可以減少其自主活動次數，延長戊巴比妥鈉所致動物的睡眠時間，延長自由活動動物等總睡眠時間，表現為鎮靜催眠作用[5-7]。同時，亦有研究發現，五味子木脂素對束縛應激引起的焦慮癥及壓力引起的抑郁癥、衰老動物的疲勞能力下降，均具有良好的抑制作用[8-9]。但五味子木脂素對于睡眠剝奪動物所致的負性情緒，易于疲勞等方面影響的研究甚少。本實驗采用小平臺睡眠剝奪裝置對大鼠進行睡眠剝奪，觀察五味子木脂素對睡眠剝奪大鼠的焦慮和抑郁等負性情緒，以及疲勞程度的影響，為把五味子開發成具有抵制睡眠剝奪所致的日間功能下降的藥物及保健食品提供了藥理學基礎。

1 材料

1.1 實驗動物

SD大鼠，雄性，體重220 g～260 g，無特定病原（specific pathogen free，SPF）級，由黑龍江中醫藥大學藥物評價中心實驗室提供，動物許可證號：SCXK（黑）2018-004。

1.2 試劑及藥物

羧甲基纖維素鈉：天津市科密歐化學試劑開發中心，生產批號：20180312；AB-8大孔樹脂：安徽三星樹脂科技有限公司，生產批號：20170504；五味子木脂素凍干粉（總木脂素含量不小于56%）：黑龍江中醫藥大學藥學院中藥藥理教研室；五味子藥材：遼寧，批號：2016111。

1.2.1 五味子木脂素凍干粉制備及配置方法

藥材浸泡12 h后經8倍量95%乙醇回流2 h，重復3次。提取液濃縮后經AB-8大孔樹脂柱吸附，乙醇液梯度洗脫，收集80%乙醇洗脫液。濃縮成浸膏，制成凍干粉，經紫外分光光度計在254 nm波長下測定凍干粉中總木脂素含量不小于56%。臨用前將五味子木脂素凍干粉與1%羧甲基纖維素鈉溶液配制成濃度為13.44 mg/mL的五味子木脂素混懸液。

1.3 儀器

FDU-1200型冷凍干燥機：上海愛朗儀器有限公司；SP-1920型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司）；小平臺睡眠剝奪裝置（90 cm×70 cm×40 cm，12個小平臺，平臺直徑為6 cm）、大平臺對照裝置（90 cm×70 cm×40 cm，12個大平臺，平臺直徑為 12 cm）：哈爾濱有機玻璃廠；負重游泳裝置（直徑50 cm，高60 cm圓桶）、強迫游泳裝置（直徑30 cm，高60 cm圓桶）：市售；高架十字迷宮：上海欣軟信息科技有限公司；KQ-300DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；1810A元素型純水機：重慶摩爾水處理設備有限公司。

2 方法

2.1 實驗分組

將實驗動物于實驗室適應環境[溫度（24±2）℃，濕度（55±15）%，12 h 明暗交替（光照：7∶00～19∶00，黑暗：19∶00～7∶00）]，動物自由獲取食物和水，一周后隨機分為3組，每組8只，分別為大平臺對照組，小平臺剝奪組和五味子木脂素組。

2.2 睡眠剝奪及給藥

大平臺對照組實驗動物置于大平臺對照裝置中，小平臺剝奪組和五味子木脂素組實驗動物分別置于小平臺睡眠剝奪裝置中，連續3 d，自由飲食和飲水。睡眠剝奪期間，大平臺對照組和小平臺剝奪組實驗動物分別經灌胃途徑每日早晚8點給予1%羧甲基纖維素鈉溶液（1.0 mL/200 g體重），五味子木脂素組實驗動物經灌胃途徑每日早晚8點給予五味子木脂素混懸液（13.44 mg/mL，1.0 mL/200 g體重），連續給藥3 d。

2.3 高架十字迷宮實驗

第4天早8點，將各組實驗動物分別從小平臺剝奪裝置和大平臺對照裝置中取出，用吹風機將其毛吹干，再放于弱光、四周有黑色簾子的高架十字迷宮上。大鼠背對實驗者，頭朝向開臂端放置，采集5 min視頻。每只大鼠做完實驗后，高架十字迷宮開臂和閉臂都必須先用低濃度酒精擦完，再用高濃度酒精擦，等酒精揮發后，按照上述步驟，再繼續放第2只大鼠，直至所有動物都做完實驗。觀看視頻，記錄動物進入開臂次數和滯留時間，閉臂次數及滯留時間，計算開臂次數比例和滯留時間比例。

2.4 強迫游泳實驗

睡眠剝奪前，先將各組大鼠置于水深45 cm，直徑30 cm 的圓桶中，水溫維持在（28±2）℃，進行 15 min的強迫游泳訓練，然后將各組動物分別置于大平臺對照裝置和小平臺睡眠剝奪裝置中，連續3 d后，從平臺裝置中取出各組實驗動物，再次將大鼠置于圓桶中游泳5 min，記錄5 min內累加靜止不動時間（即大鼠除了為避免沒入水中而向上的運動外而無其它行為的時間）。

2.5 負重游泳實驗

第4天早8點，各組實驗動物分別從小平臺剝奪裝置和大平臺對照裝置中取出，用吹風機將其毛吹干。然后在大鼠尾部負重，重量為大鼠體重5%的鉛塊。負重后的大鼠，立即放入水深45 cm，直徑50 cm的圓桶中，水溫維持在（28±2）℃，進行負重強迫游泳實驗。記錄大鼠力竭時間（即從大鼠放入圓桶中開始計時，直至大鼠沉入桶底超過10 s沒有再次游上水面呼吸的持續時間）。

2.6 統計學處理

3 結果

3.1 五味子木脂素對睡眠剝奪大鼠焦慮樣行為的影響

五味子木脂素對睡眠剝奪大鼠進入開臂次數及時間比例的影響結果見圖1。

圖1 五味子木脂素對睡眠剝奪大鼠進入開臂次數及時間比例的影響（±S.E.M.，n=8）Fig.1 Effect of Schisandra lignans on the ratio of the time to open the arm and the number of open arms of rats with sleep deprivation（±S.E.M.，n=8）

與大平臺對照組相比，小平臺剝奪組大鼠的進入開臂時間比例和開臂次數比例明顯減少，具有顯著性差異（p＜0.05）。與小平臺剝奪組相比，五味子木脂素組大鼠的進入開臂時間比例和開臂次數比例明顯增加，具有極顯著性差異（p＜0.01）。

3.2 五味子木脂素對睡眠剝奪大鼠抑郁樣行為的影響

五味子木脂素對睡眠剝奪大鼠不動時間的影響結果見圖2。

圖2 五味子木脂素對睡眠剝奪大鼠不動時間的影響（±S.E.M.，n=8）Fig.2 Effect of Schisandra lignans on immobility time in rats with sleep deprivation（±S.E.M.，n=8）

與大平臺對照組相比，小平臺剝奪組大鼠的強迫游泳不動時間明顯延長，有極顯著性差異（p＜0.01）。與小平臺剝奪組相比，五味子木脂素組大鼠的強迫游泳不動時間明顯減少，有極顯著性差異（p＜0.01）。

3.3 五味子木脂素對睡眠剝奪大鼠疲勞程度的影響

五味子木脂素對睡眠剝奪大鼠力竭時間的影響結果見圖3。

圖3 五味子木脂素對睡眠剝奪大鼠力竭時間的影響（±S.E.M.，n=8）Fig.3 Effect of Schisandra lignans on exhaustion time of rats with sleep deprivation（±S.E.M.，n=8）

與大平臺對照組相比，小平臺剝奪組大鼠的游泳至力竭時間明顯減少，有極顯著性差異（p＜0.01）。與小平臺剝奪組相比，五味子木脂素組大鼠的游泳至力竭時間明顯延長，有極顯著性差異（p＜0.01）。

4 結論與討論

本實驗結果顯示，五味子木脂素能增加睡眠剝奪大鼠進入開臂時間和次數的比例，減少大鼠強迫游泳不動時間，延長大鼠游泳至力竭時間，具有明顯對抗睡眠剝奪所致的焦慮，抑郁和疲勞的作用。高架十字迷宮利用大鼠對新異環境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼心理，形成的矛盾沖突從而考察動物焦慮狀態，動物進入開放臂次數比例和進入開放臂停留時間比例與焦慮程度直接相關[10]，是抗焦慮研究中應用最廣泛的模型之一。睡眠剝奪后的大鼠進入開臂時間及次數比例明顯減少、表現出明顯的焦慮樣狀態。強迫游泳實驗可以很好的模擬人類抑郁情緒，被廣泛用于抗抑郁藥的篩選和評價[11]。其不動的時間可作為評價抑郁行為的指標，動物不動時間增加即出現抑郁傾向。若藥物可減少動物的不動時間，即提示該藥物可能具有抗抑郁活性[12]。睡眠剝奪后的大鼠強迫游泳不動時間明顯延長，表現出明顯的抑郁樣狀態。疲勞主要表現為體力和運動耐力下降，負重游泳實驗裝置簡單，實驗結果能直接客觀地反映動物的體能，是最為常用的運動耐力測定方法[13]。睡眠剝奪后的大鼠游泳至力竭時間明顯減少，表現為易于疲勞。結合3個行為指標綜合探討了五味子木脂素對睡眠剝奪大鼠日間行為的影響，為五味子改善睡眠剝奪大鼠的日間功能提供了藥理學基礎。