響應面法優化黃芪固體發酵工藝

劉超，陳俊榮，于春濤

（滄州醫學高等?？茖W校，河北滄州061001）

黃芪是豆科植物蒙古黃芪或莢膜黃芪的根，具有補氣固表、利水退腫、托毒排膿、生肌等功效[1]。黃芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）是從中藥黃芪中提取的生物活性成分之一，具有增強免疫系統功能、抗炎癥、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老、降血糖等作用，在糖尿病和心血管疾病防治中也起著重要作用[2]。對于黃芪發酵方式的研究以液體發酵為主，固體發酵的研究相對較少。固體發酵具有操作簡便，能耗低，發酵過程易控制，對無菌要求相對較低，不易發生大面積污染等優點[3-4]。黃芪中的有效成分黃芪甲苷經食藥用真菌固體發酵后發生一定程度的轉化，且具有增效作用[5-6]。黃芪渣經固體發酵后可有效降解纖維素，促進黃芪甲苷的析出，在動物飼料生產中具有重要意義[7-8]。用于黃芪固體發酵的菌種較廣泛，有靈芝、桑黃、香菇、蟲草菌、乳酸菌、芽孢桿菌等。黑曲霉是重要的發酵工業菌種，可生產淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、檸檬酸、葡糖酸和沒食子酸等，還可利用黑曲霉得到苷元[9]。

本文以黃芪粗多糖的含量為響應值，在單因素試驗基礎上，采用統計軟件Design-Expert中響應面法的Box-Behnken模式，對黑曲霉固體發酵黃芪工藝進行研究[10-11]，為黃芪的開發與利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BS 223S分析天平：賽多利斯科學儀器有限公司；KN-130萬能粉碎機：長沙康寧電子科技有限公司；超凈工作臺：海爾股份有限公司；MJ-78A全自動滅菌鍋：施都凱儀器設備有限公司；HWS恒溫恒濕培養箱：北京科偉永興儀器有限公司；756S/759S紫外可見分光光度計：上海棱光技術有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；101A-2恒溫鼓風干燥箱：常州金壇良友儀器有限公司；ZWY-240恒溫培養振蕩器：上海智誠科技有限公司。

1.2 材料

黃芪：安國藥材市場，經鑒定為蒙古黃芪；黑曲霉：滄州醫學高等?？茖W校藥物研究所；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）：北京奧博星生物技術有限公司；D-無水葡萄糖（99.9%）：中國食品藥品檢定研究院；其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 菌種培養

配制PDA瓊脂斜面培養基，在超凈工作臺上將保藏的黑曲霉菌種接種于斜面培養基上，37℃恒溫培養，觀察菌種管內黑曲霉長滿孢子，即得活化菌種。從PDA斜面培養基上取適量的黑曲霉孢子，用無菌水制成1×108孢子/mL的懸濁液，取1 mL接種于100 mL PDA液體培養基中，并于28℃、160 r/min培養24 h，得種子液用于接種發酵[12]。

2.2 發酵產物制備

將黃芪干燥，粉碎，精確稱量50.0 g黃芩藥材粉末，置入250 mL錐形瓶，加入75 mL蒸餾水，混勻，121℃高壓滅菌20 min，即得含水量60%的黑曲霉發酵培養基。按一定接種比例將黑曲霉菌液接入固體發酵培養基中，在一定溫度下恒溫培養，培養一定時間后取出，用于多糖含量的測定。

2.3 發酵工藝單因素試驗

2.3.1 發酵時間對黃芪多糖含量的影響

按5%接種量將種子液接入固體發酵培養基中，28 ℃恒溫培養，發酵時間分別為 3、5、7、9、11 d ，測定發酵產物多糖含量。

2.3.2 發酵溫度對于黃芪多糖含量的影響

按5%接種量將種子液接入固體發酵培養基中，恒溫培養 7 d，發酵溫度分別為 20、24、28、32、36 ℃，測定發酵產物多糖含量。

2.3.3 接種量對于黃芪多糖含量的影響

按接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%，將種子液接入固體發酵培養基中，28℃恒溫培養7 d，測定發酵產物多糖含量。

2.4 響應面分析試驗

根據單因素試驗結果，選擇接種量、發酵時間、發酵溫度這3個因素為自變量。根據Box-Benhnken設計原理，進行三因素三水平的響應面分析試驗，因素水平設計見表1。

表1 響應面因素水平表Table 1 Factors and levels of the response surface design

2.5 黃芪多糖含量測定

準確稱取減壓、干燥至恒重的葡萄糖20 mg，置入100 mL的量瓶，加水配制成0.2 mg/mL的葡萄糖溶液。分別吸取對照品溶液 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0 mL，置入25.0 mL量瓶，加水稀釋至刻度，各精密吸取2.0 mL，置入具塞試管，加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，再垂直迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻。室溫靜置10 min，沸水浴15 min，冷卻后在490 nm波長處測吸光度。根據測定的吸光度繪制標準曲線。將樣品梯度稀釋500倍，稀釋后取2 mL置入具塞管，用同樣的方法測定吸光度，計算發酵樣品中多糖含量[13-14]。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 發酵時間對黃芪多糖含量的影響

發酵時間對黃芪多糖含量的影響見圖1。

圖1 發酵時間對多糖含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on polysaccharides content

由圖1可見，發酵前期主要為菌體增長階段，中后期主要為代謝物質積累階段，7 d前發酵液中多糖含量隨發酵時間的增長而增高，至7 d時達最高。但當發酵時間再增加時，多糖含量卻有略微下降。分析原因為培養前期，發酵培養基中營養充足，菌體生長達到一定階段產生大量多糖，但隨著培養基的不斷消耗，出現營養供給不足現象，黑曲霉菌體生長消耗部分多糖，使其含量下降。

3.1.2 發酵溫度對黃芪多糖含量的影響

發酵溫度對黃芪多糖含量的影響見圖2。

圖2 發酵溫度對多糖含量的影響Fig.2 Effect of temperature on polysaccharides content

由圖2可見，溫度對黃芪發酵產物中多糖含量的影響明顯，低溫和高溫都不適于代謝產物的積累。當溫度低于28℃時，多糖含量隨溫度的升高而逐漸增加，超過28℃后，多糖含量下降，尤其超過32℃后，多糖含量下降明顯。此結果說明黑曲霉發酵黃芪的適宜溫度為28℃左右，高溫和低溫都不適合黑曲霉發酵。

3.1.3 接種量對黃芪多糖含量的影響

接種量對黃芪多糖含量的影響見圖3。

由圖3可見，隨著接種量的不斷增加，黑曲霉發酵黃芪多糖含量逐漸增大，接種量為5%時，多糖含量達最大，然后隨接種量的增大，多糖含量開始逐漸降低。分析原因為：接種量小于5%時，隨接種量的增加，發酵培養基中黑曲霉數量不斷增加，多糖產量增高。當接種量大于5%時，發酵培養基中黑曲霉數量過多，需氧量增大，對培養基營養成分消耗加快，導致多糖含量下降。結果表明黑曲霉產黃芪多糖的最佳接種量為5%。

圖3 接種量對多糖含量的影響Fig.3 Effect of inoculum concentration on polysaccharides content

3.2 發酵工藝響應面分析試驗

3.2.1 數學模型的建立及顯著性檢驗

在單因素試驗結果的基礎上，以發酵時間、發酵溫度、接種量3個因素為自變量，以黃芪多糖含量為響應值，采用Design-Expert回歸分析軟件進行三因素三水平的試驗設計，共包含17組試驗方案。響應面分析試驗和結果見表2。

表2 響應面分析試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface analysis

分析表2中17個試驗點的響應值，對表2試驗數據進行綜合分析，各因素對多糖含量的影響可用如下回歸方程表示：多糖含量Y=85.47+1.42×A+2.07×B+1.11×C+0.53×AB-0.29×AC-1.73×BC-5.49×A2-6.38×B2-9.59×C2。

回歸分析見表3。

通過對模型進行方差分析可見：P模型＜0.000 1，表明模型差異極顯著；多糖含量失擬項P=0.964 9，表明失擬不顯著，所選用的二次回歸模型是適當的；對模型進行回歸方程系數顯著性檢驗，得到模型一次項B（P＜0.01）差異極顯著，一次項 A、C（P＜0.05）差異顯著，其影響強弱的排序為：發酵溫度＞發酵時間＞接種量。

3.2.2 響應面分析

根據回歸方程繪制響應面曲面圖和等高線圖，響應面圖形能直觀地反映各因素及其交互作用對響應值的影響。響應面圖形是響應值Y與試驗因素A、B、C相對應構成的三維空間曲線圖，試驗結果見圖4。

表3 擬合二次多項式模型的方差分析Table 3 Variance analysis of response surface quadratic mode

圖4 各因素交互作用對多糖含量影響的響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour line showing the effects of two factors on polysaccharides contents

響應面的曲線圖中，各因素間交互作用越強，曲線走勢越陡，其影響越顯著；交互作用越小，曲線走勢越平滑，其影響越小。由圖4可見，發酵時間、發酵溫度和接種量3個因素相互之間的交互作用較強，隨著任意兩個變量的增加均呈上升趨勢，當達到某一峰值后，曲面下降，通過響應面圖能夠觀察出最高點。

3.2.3 驗證試驗

通過對回歸模型方程求解，得出黃芪固體發酵多糖最佳發酵工藝為發酵時間7.27 d，發酵溫度28.65℃，接種量5.08%，在此條件下多糖預計含量為85.75mg/g。為了便于試驗，把發酵參數進行調整如下：發酵時間7.3 d，發酵溫度28.5℃，接種量5%，進行3組平行試驗，所得多糖的含量的分別為84.87、85.24、83.10 mg/g，其平均值84.74 mg/g，與理論值誤差為1.57%，表明該回歸方程可用于實踐。

4 結論

黃芪多糖是黃芪中重要的活性成分之一，具有來源豐富、價格低廉、長期使用對組織細胞毒副作用小、殘留低的特點，在人類和動物疾病防治方面具有廣闊的前景。本文采用Design-Expert軟件，以黃芪粗多糖的含量為響應值，在單因素試驗基礎上，優化了黑曲霉固體發酵黃芪工藝。通過響應面分析得到多糖含量和發酵時間、發酵溫度、接種量因素的模型方程，各因素影響強弱順序為：發酵溫度＞發酵時間＞接種量，由模型得最佳發酵工藝條件及預測多糖含量為85.75 mg/g。調整發酵參數為發酵時間7.3 d，發酵溫度28.5℃，接種量5%，進行驗證試驗，經過3組平行試驗，所得多糖含量平均值84.74 mg/g，與理論值接近，表明該模型可較好地應用于黃芪固體發酵工藝的優化。