膠體金快速定量法測定糧食中鎘的方法鑒定

劉美辰

（北京市糧油食品檢驗所，北京100162）

隨著工業(yè)、城市污染的加劇，土壤重金屬污染日益嚴(yán)重，被重金屬鎘污染的糧食會危害人體健康，影響機體代謝，使其發(fā)生紊亂，誘發(fā)疾病，甚至死亡[1-2]。

世界各國對鎘的最大允許含量均有限定要求，并作為強制性檢測項目進行檢測[3]，我國《糧食管理流通條例》（國務(wù)院令第407號）和GB 2715-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)糧食》也都明確規(guī)定糧食收購要對鎘進行檢測。由于我國糧油種植區(qū)分布廣泛，糧食收購多集中在縣以下單位的收儲庫點，時間短，收購量大，能否快速、準(zhǔn)確地檢測鎘成為影響糧食收購效率的重要因素[4]。目前檢測糧食中鎘常用的方法有石墨爐原子吸收光譜法[5]、原子熒光光譜法[6]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[7]等，這些方法均對試驗條件和檢測技術(shù)有較高要求，檢測時間長，檢測步驟繁瑣，成本太高，都不能滿足現(xiàn)場快速檢測的需要。因此，建立簡便、高效、低成本的快速檢測方法迫在眉睫。

近年來快速發(fā)展的免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原-抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，已在病原[8-9]、真菌毒素[10-11]、殺菌劑[12]、抗生素[13]和興奮劑[14]等檢測項目上廣泛應(yīng)用并已標(biāo)準(zhǔn)化。目前可用于糧食中鎘檢測的膠體金快速定量法已見報道[15-16]，為驗證該方法適用于國家標(biāo)準(zhǔn)的可行性，對其檢出限、定量限、準(zhǔn)確性、重復(fù)性、穩(wěn)定性、臺間差和檢測時長等參數(shù)進行了測試，為該方法的標(biāo)準(zhǔn)化工作提供了試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重金屬鎘快速定量檢測試紙條：北京華安麥科生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品批次20180524，規(guī)格16 T/盒。盒內(nèi)配有試驗所需的樣品提取液、萃取劑、反萃取劑、稀釋液和螯合劑，未標(biāo)注明確成分。

1.2 儀器與設(shè)備

干式加熱器（HMG-GS）、計時器：北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；膠體金讀數(shù)儀3臺（BMZ 6000）：北京美正生物科技有限公司；移液器（200 μL）：賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司；離心管（20 mL和50 mL）：潔特；一次性手套：麥迪康；離心機（DM0412）：大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司；原子吸收光譜儀（PinAAcle 900T）：Perkinelmer公司；渦旋混合器（TZL-5013）：蘇州珀西瓦爾實驗設(shè)備有限公司；分析天平（PL-602E）：梅特勒-托利多。

1.3 檢測原理

膠體金快速定量法應(yīng)用了競爭抑制膠體金免疫層析的原理，將金標(biāo)抗體結(jié)合在金標(biāo)墊/微孔中，將抗原（T線）和二抗（C線）固定于硝酸纖維素膜（NC膜）上，當(dāng)待測樣品加到樣品墊/微孔中后，樣本中抗原與金標(biāo)抗體結(jié)合，通過層析作用向前移動。當(dāng)移至（T線）區(qū)域時，偶聯(lián)抗原和未結(jié)合金標(biāo)抗體結(jié)合而被截留，聚集在檢測線（T線）上，剩余金標(biāo)抗體越過檢測線（T線），在質(zhì)控線（C線）處與二抗結(jié)合顯色，配合膠體金讀數(shù)儀可直接讀取檢測結(jié)果。

1.4 操作方法

膠體金快速定量法：按照重金屬鎘快速定量檢測試紙條盒內(nèi)附帶的操作說明進行，具體為稱取2.0 g±0.02 g均質(zhì)（過20目篩網(wǎng)）樣本于50 mL離心管中，加入6 mL樣品提取液和4 mL萃取劑，具塞，充分振蕩5min后，4000r/min離心5min；取1mL上清，加入2mL反萃取劑，振蕩3 min，4 000 r/min離心3 min；棄上清，取500 μL下清，立即加入2 mL稀釋液（5 min內(nèi)），振蕩混勻；取 250 μL 該混合液，加入 200 μL 螯合劑，振蕩均勻，1 min內(nèi)待檢。

石墨爐原子吸收光譜法：按照國標(biāo)GB 5009.15-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鎘的測定》執(zhí)行。

1.5 樣品

據(jù)國家統(tǒng)計局公告，2012年我國糧食總產(chǎn)量為58 957萬噸，而稻谷、小麥和玉米三大作物的總產(chǎn)量占糧食總產(chǎn)量的90.4%（其中稻谷20 429萬噸，小麥12 058萬噸，玉米20 812萬噸），故選擇大米/糙米、小麥和玉米為研究對象。測試采用陽性樣品、陰性樣品和陽-陰定量混配樣品進行，所有樣品均使用國家標(biāo)準(zhǔn)方法（石墨爐原子吸收光譜法）定值。

國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2762-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》中規(guī)定大米/糙米中鎘的限量值為200 μg/kg、小麥和玉米中鎘的限量值為 100 μg/kg。根據(jù)國標(biāo)限量值和實際樣品的污染情況，選取50 μg/kg～100 μg/kg、100 μg/kg～200 μg/kg 和 300 μg/kg～350 μg/kg 3個濃度水平的大米/糙米樣品；選取50μg/kg～100μg/kg、100 μg/kg～150 μg/kg 和 150 μg/kg～250 μg/kg 3 個濃度水平的小麥和玉米樣品進行測試。大米/糙米、小麥和玉米的陰性樣品各20份，大米/糙米的天然陽性樣品3份，小麥的天然陽性樣品1份，小麥的陽-陰定量混配樣品2份，玉米的天然陽性樣品1份，玉米的陽-陰定量混配樣品2份，共計69份樣品進行測試。

每份測試樣品均從大樣經(jīng)粗碎與連續(xù)多次用四分法縮減至0.5 kg～1 kg，粉碎至80%以上過20目篩，篩上物和篩下物混勻。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法檢出限及定量限

依據(jù)LS/T 6402-2017《糧油檢驗設(shè)備和方法標(biāo)準(zhǔn)適用性驗證及結(jié)果評價一般原則》中6.1的規(guī)定，使用膠體金快速定量法連續(xù)獨立測定20個陰性樣品，根據(jù)檢出限=陰性樣品測定平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差、定量限=陰性樣品測定平均值+10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，計算得出該方法的檢出限和定量限，具體見表1。

表1 方法檢出限和定量限Table 1 The test result of limit of detection and limit of quantitation μg/kg

如表1所示，該方法測定大米/糙米的檢出限為17.23 μg/kg，定量限為 48.84 μg/kg；測定小麥的檢出限為 13.42 μg/kg，定量限為 39.35 μg/kg；測定玉米的檢出限為 14.86 μg/kg，定量限為 44.59 μg/kg，與國標(biāo)限量值相比可知該方法能夠滿足國標(biāo)檢測要求。

2.2 準(zhǔn)確性

依據(jù)LS/T 6402-2017《糧油檢驗設(shè)備和方法標(biāo)準(zhǔn)適用性驗證及結(jié)果評價一般原則》中6.2的規(guī)定，使用膠體金快速定量法與石墨爐原子吸收光譜法分別對大米/糙米、小麥和玉米樣品進行雙試驗檢測，取平均值作為檢測結(jié)果，并采用配對t檢驗法比較兩種方法的檢測結(jié)果是否存在顯著性差異。使用EXCEL函數(shù)計算兩種方法檢測結(jié)果的差值Di、D均值、SD和tD，具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 準(zhǔn)確度測試結(jié)果Table 2 The test result of accruacy

查 t分布表可知，t0.05，8=2.306，而計算值 tD=1.16＜t0.05，8，tD未超過查表值說明兩種方法的測定結(jié)果之間無顯著差異。

2.3 重復(fù)性

依據(jù)LS/T 6402-2017《糧油檢驗設(shè)備和方法標(biāo)準(zhǔn)適用性驗證及結(jié)果評價一般原則》中6.3的規(guī)定，采用一臺驗證用設(shè)備6次重復(fù)測定中等濃度水平的大米、小麥和玉米樣品，采用χ2檢驗法判斷該方法重復(fù)性測定標(biāo)準(zhǔn)差是否超過標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的重復(fù)性要求，同時采用6次測定極差與現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的6次測定重復(fù)性臨界極差進行對照，考察該方法的重復(fù)性，具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 重復(fù)性測試結(jié)果Table 3 The test result of repeatability

2.3.1 大米樣品

測定次數(shù)n=6，平均值194.07 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差S=11.13 μg/kg，極差=29.26 μg/kg；GB 5009.15-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鎘的測定》規(guī)定重復(fù)性條件下，兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%，則大米樣品兩次測定絕對差（即重復(fù)性限r(nóng)）≤38.81，國標(biāo)規(guī)定的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差Sr=r/2.8=13.86，6次測定的重復(fù)性臨界極差CrR95（6）=f（6）×Sr=55.44，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差χ2=（n-1）S2/Sr2=3.22。顯著性水平α=0.05情況下，查表得 χ20.95(5)=11.07，χ2=3.22＜χ20.95(5)，且極差29.26＜重復(fù)性臨界極差CrR95（6），說明該方法測定大米/糙米樣品中重金屬鎘的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差和極差均不超過國家標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的重復(fù)性要求。

2.3.2 小麥樣品

測定次數(shù)n=6，平均值117.18 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差S=1.62 μg/kg，極差=3.86 μg/kg；GB 5009.15-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鎘的測定》規(guī)定重復(fù)性條件下，兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%，則小麥樣品兩次測定絕對差（即重復(fù)性限r(nóng)）≤23.44，國標(biāo)規(guī)定的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差Sr=r/2.8=8.37，6次測定的重復(fù)性臨界極差CrR95（6）=f（6）×0.95(5)=33.48，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差χ2=（n-1）S2/Sr2=0.19。顯著性水平 α=0.05情況下，查表得 χ20.95(5)=11.07，χ2=0.19＜χ20.95(5)，且極差 3.86＜重復(fù)性臨界極差CrR95（6），說明該方法測定小麥樣品中重金屬鎘的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差和極差均不超過國家標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的重復(fù)性要求。

2.3.3 玉米樣品

測定次數(shù)n=6，平均值131.38 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差S=3.29 μg/kg，極差=7.76 μg/kg；GB 5009.15-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鎘的測定》規(guī)定重復(fù)性條件下，兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%，則玉米樣品兩次測定絕對差（即重復(fù)性限r(nóng)）≤26.28，國標(biāo)規(guī)定的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差Sr=r/2.8=9.39，6次測定的重復(fù)性臨界極差CrR0.95(6)=f（6）×Sr=37.56，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差χ2=（n-1）S2/Sr2=0.61。顯著性水平α=0.05情況下，查表得 χ20.95(5)=11.07，χ2=0.61＜χ20.95(5)，且極差 7.76＜重復(fù)性臨界極差CrR95（6），說明該方法測定玉米樣品中重金屬鎘的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差和極差均不超過國家標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的重復(fù)性要求。

2.4 穩(wěn)定性

依據(jù)LS/T 6402-2017《糧油檢驗設(shè)備和方法標(biāo)準(zhǔn)適用性驗證及結(jié)果評價一般原則》中6.4的規(guī)定，采用一臺驗證用設(shè)備持續(xù)開機24 h，對中等濃度水平的大米樣品（190.2 μg/kg）連續(xù)測定13次，以測定數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差和極差是否超過標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的重復(fù)性要求來考察設(shè)備的穩(wěn)定性，具體數(shù)據(jù)見表4。

表4 穩(wěn)定性測試結(jié)果Table 4 The test result of stability

測定次數(shù)n=13，平均值199.89 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差S=6.59 μg/kg，極差=20.92 μg/kg；GB 5009.15-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鎘的測定》規(guī)定重復(fù)性條件下，兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%，則兩次測定絕對差（即重復(fù)性限r(nóng)）≤39.98，國標(biāo)規(guī)定的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差Sr=r/2.8=14.28，13次測定的重復(fù)性臨界極差CrR95（13）=f（13）×Sr=67.12，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差χ2=（n-1）S2/Sr2=2.56。顯著性水平α=0.05情況下，查表得 χ20.95(12)=21.03，χ2=2.56＜χ20.95(12)，且極差 20.92＜重復(fù)性臨界極差CrR95（13），說明該方法測定的穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)差和極差均不超過國家標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的重復(fù)性要求。

2.5 臺間差

依據(jù)LS/T 6402-2017《糧油檢驗設(shè)備和方法標(biāo)準(zhǔn)適用性驗證及結(jié)果評價一般原則》中6.5的規(guī)定，采用兩臺驗證用設(shè)備分別對大米/糙米、小麥和玉米樣品進行雙實驗檢測，取平均值作為檢測結(jié)果，并采用配對t檢驗法比較兩臺設(shè)備的檢測結(jié)果是否存在顯著性差異。根據(jù)兩臺設(shè)備的檢測結(jié)果，用EXCEL函數(shù)計算差值Di、D均值、SD和tD，具體數(shù)值見表5。

表5 臺間差測試結(jié)果Table 5 The test result of inter-instrument agreement

因 tD=1.48，查 t分布表，t0.05，8=2.306，tD＜t0.05，8，tD未超過查表值說明兩臺設(shè)備的測定結(jié)果之間無顯著性差異，即臺間差滿足檢測要求。

3 結(jié)論

該方法前處理過程簡單，非專業(yè)技術(shù)人員略加培訓(xùn)即可操作；檢測速度快，單個樣品檢測時間僅需35 min；無需使用標(biāo)準(zhǔn)品及大量有機試劑，對人員和環(huán)境危害小；測試結(jié)果可直接從讀數(shù)儀上讀取，消除了人為誤差；整套裝置輕便易攜，檢測成本低，因此具有簡單、快捷、低成本、高效率等優(yōu)點，十分適合糧食收購現(xiàn)場和基層實驗室的快速檢測。另外，該方法的檢出限、定量限、準(zhǔn)確性、重復(fù)性、穩(wěn)定性和臺間差等參數(shù)均滿足LS/T 6402-2017《糧油檢驗設(shè)備和方法標(biāo)準(zhǔn)適用性驗證及結(jié)果評價一般原則》的要求，故該方法能夠定量測定大米/糙米、小麥和玉米小麥中鎘的含量。基于該方法能夠滿足糧食收購現(xiàn)場對鎘快速定量測定的需求，建議在進一步研究的基礎(chǔ)上，制定膠體金快速定量法測定糧食中鎘的技術(shù)規(guī)范或方法標(biāo)準(zhǔn)，使該方法能夠得到推廣應(yīng)用。