超高效液相色譜法測(cè)定牛奶及奶制品中四環(huán)素類藥物殘留

李桂琴（興安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古烏蘭浩特137400）

近年來，四環(huán)素類抗生素作為獸藥應(yīng)用廣泛，已經(jīng)成為獸用抗生素殘留重大問題之首，因其價(jià)格便宜、廣譜、快速抑菌等作用，對(duì)動(dòng)物還有良好的促生長(zhǎng)效果[1-2]，用于預(yù)防和治療畜禽疾病，特別是用于奶牛乳腺炎和子宮炎的預(yù)防和治療[3]，但藥物使用不當(dāng)或過量會(huì)導(dǎo)致在奶牛體內(nèi)殘留，并進(jìn)入食物鏈[4]。長(zhǎng)期食用含有四環(huán)素類的食品容易造成胃腸以及肝臟損害、牙齒染色、過敏反應(yīng)、二重感染、致畸胎作用，甚至能抑制人體骨髓造血功能而引起再生障礙性貧血和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病[5-6]。因此，對(duì)食品中獸用藥物殘留的檢測(cè)十分重要，而且刻不容緩。

目前，國(guó)內(nèi)外四環(huán)素的檢測(cè)方法有高效液相色譜法[6-10]、薄層色譜法[10]、電泳法[10]、微生物法[10-11]、化學(xué)發(fā)光法[11]、超高效液相色譜法[12-15]、液質(zhì)聯(lián)用法[16]、共振散射光譜法[17]、傳感器法[18]、液-質(zhì)/質(zhì)聯(lián)用法[19]、免疫分析法[20]等。因高效液相色譜法具有快速、靈敏度和精密度高、回收效果好等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于基質(zhì)比較復(fù)雜的四環(huán)素類獸藥殘留檢測(cè)。

四環(huán)素類抗生素檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)是GB/T5009.116-2003《畜、禽肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素殘留量的測(cè)定（高效液相色譜法）》，采用的是高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定。與傳統(tǒng)的高效液相色譜相比，超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC） 與 傳 統(tǒng)的HPLC相比，UPLC的速度、靈敏度及分離度都高于HPLC，分析時(shí)間短，同時(shí)溶劑用量少，分析成本降低。所以本文把牛奶及奶制品中的四環(huán)素類抗生素殘留作為研究對(duì)象，采用了超高效液相色譜法測(cè)定了四環(huán)素類獸藥殘留的含量，重點(diǎn)研究了樣品的前處理，提取劑、沉淀劑、凈化柱等的選擇，結(jié)果回收率高，能夠?yàn)槟讨破分械乃沫h(huán)素類藥物殘留檢測(cè)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

15個(gè)樣品采購(gòu)于烏蘭浩特喜登來超市，金島家樂福超市以及歐亞超市，詳見表1。

表1 樣品Table 1 Samples

乙腈，磷酸二氫鈉，甲酸，草酸，甲醇，乙二胺四乙酸二鈉/檸檬酸、磷酸氫二鈉（Na2EDTA-Mcllvaine）：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；土霉素，四環(huán)素，金霉素，多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于99.99%）：天津大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀（Agilent1290）：美國(guó)安捷倫公司；湘儀離心機(jī)（TDZ5-WS）：湖南湘儀集團(tuán)；超聲波清洗（SB-5200DTD型）：上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司；水浴氮吹儀（YGC-12D型）：鄭州寶晶電子科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000A）：上海亞榮儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：WatersAtalantisT3（2.1mm×150mm，3μm）；流動(dòng)相：A為水，B為乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：20 ℃。流動(dòng)相梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱取一定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用乙腈定容至濃度均為100.0 μg/mL；于-18℃避光保存。

1.3.3 樣品的前處理

1.3.3.1 提取

以回收率為考察指標(biāo)，通過比較乙腈/水（體積比4∶1）、Na2EDTA-Mcllvaine、草酸-乙腈溶液 3 種溶劑對(duì)樣品進(jìn)行浸提，最終確立了用乙腈/水作為提取液提取。

準(zhǔn)確稱取試樣10 g于50 mL具塞量筒中，加入乙腈/水溶液（體積比 4∶1）20 mL，加入無水乙醇溶液10 mL，充分混合振蕩2min，以3000r/min離心10 min，將上清液過濾至另一離心管中。重復(fù)提取一次，合并上層清液，待凈化。

1.3.3.2 凈化

比較了HLB萃取小柱、氨基柱和C18柱，因氨基柱對(duì)目標(biāo)物有較好的凈化效果，最后確立了用氨基柱凈化。

首先用10 mL甲醇水溶液（體積比1∶1）處理氨基固相萃取柱，然后將上層清液倒入萃取柱，待上清液流出后，用3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%甲醇的水溶液淋洗，棄去全部流出液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，最后用5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的甲醇洗脫，收集洗脫液于10 mL樣品管中，于45℃氮?dú)獯蹈桑? mL流動(dòng)相溶解，最后過0.45 μm濾膜，待測(cè)。

1.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將 1 號(hào)牛奶樣品的制備液分別于 0、2、4、6、8、12、16、20、24 h測(cè)定，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算四環(huán)素類藥物含量，根據(jù)公式：相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差/%=標(biāo)準(zhǔn)偏差（mg/kg）/四環(huán)素類藥物含量的算術(shù)平均值（mg/kg）×100，計(jì)算并討論樣液是否符合穩(wěn)定性試驗(yàn)要求。

1.3.5 精密度試驗(yàn)

取1號(hào)牛奶樣品制備好的樣液連續(xù)進(jìn)樣5次進(jìn)行精密度試驗(yàn)，計(jì)算四環(huán)素類藥物含量，并討論精密度是否符合試驗(yàn)要求。

1.3.6 線性回歸方程

分別將各標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)使用液按照試驗(yàn)要求，配置一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按照色譜條件進(jìn)行線性回歸方程試驗(yàn)，根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和相應(yīng)的四環(huán)素類藥物含量結(jié)果計(jì)算線性回歸方程及其相關(guān)系數(shù)。

1.3.7 回收率試驗(yàn)

取1號(hào)牛奶、1號(hào)酸奶、1號(hào)奶粉為例，樣品各3份，將一定量的低、中、高3個(gè)濃度的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)使用溶液分別加入到樣品中，然后按照上述前處理方式處理樣品，按照色譜條件進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算四環(huán)素含量，根據(jù)公式：回收率/%=回收量（μg/mL）/加入量（μg/mL）×100，計(jì)算四環(huán)素藥物的回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

乙腈/水溶液、Na2EDTA-Mcllvaine溶液、草酸-乙腈溶液提取后的回收率結(jié)果如表3。

表3 不同提取劑的回收率Table 3 Recovery of different extractants

由表3可知，乙腈/水溶液（體積比4：1）提取的回收率高，雖然Na2EDTA-Mcllvaine溶液提取后的回收率高，但是除去多余的Na2EDTA-Mcllvaine溶液存在困難，而且會(huì)對(duì)色譜柱的壽命產(chǎn)生影響。乙腈的極性適中，對(duì)獸藥殘留有較好的溶解能力，另外乙腈還可以促使部分蛋白質(zhì)變性沉淀從而提高提取效率。所以最終確立了用乙腈/水作為提取液。

此外，乙腈/水溶液體積比為 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1對(duì)回收率的影響見表4。

表4 不同體積比的回收率Table 4 Recovery rates by volume ratio

結(jié)果表明隨著乙腈比例的增大，回收率也相應(yīng)提高，但是體積比為5∶1和4∶1時(shí)回收率差別不明顯，因此最終選擇乙腈和水最佳體積比為4∶1。

2.2 沉淀劑的選擇

分析了硫酸銅溶液、亞鐵氰化鉀-乙酸鋅溶液、無水乙醇作為沉淀試劑的優(yōu)劣。奶及奶制品里含有大量的油脂以及蛋白質(zhì)，對(duì)提取不利，而且也會(huì)污染色譜柱，影響檢測(cè)工作。硫酸銅溶液沉淀蛋白質(zhì)含量低的樣品效果較理想，但是針對(duì)乳品沉淀效果不理想；亞鐵氰化鉀-乙酸鋅溶液沉淀效果較為理想，但是亞鐵氰化鉀溶液可能產(chǎn)生峰拖尾的現(xiàn)象，而且會(huì)對(duì)色譜柱產(chǎn)生不利的影響，所以不予采用；使用無水乙醇水浴沉淀，對(duì)色譜柱無損傷，操作簡(jiǎn)便、快捷，因此最終采用了無水乙醇水浴沉淀的方式。

不同水浴溫度對(duì)回收率的影響見表5。

表5 不同水浴溫度的回收率Table 5 Recovery rates of different water bath temperatures

由表5可知，隨著水浴溫度的升高，回收率也相應(yīng)提高。所以最終選擇了70℃作為水浴溫度。

2.3 凈化柱的選擇

HLB萃取小柱、C18柱和氨基柱的對(duì)回收率的影響見表6。

表6 不同凈化柱的回收率Table 6 Recovery rates of different purification columns

由表6可知，采用氨基柱凈化的效果高于HLB萃取小柱和C18的效果，所以最終采用氨基柱作為凈化柱。

2.4 線性回歸方程

將各標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)使用液配制成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后按照進(jìn)樣操作，將峰高為縱坐標(biāo)，以含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回歸方程。四環(huán)素的線性回歸方程為y=11.90x+71.23，r=0.999 8，土霉素的線性回歸方程為y=212 410x+19 385，r=0.999 8，金霉素的線性回歸方程為y=5.097 1x+36.92，多西環(huán)素的線性回歸方程為y=7.125x+9.151，r=0.999 9，線性關(guān)系均良好。

2.5 精密度

取四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)使用液配制低、中、高3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度分別為 10、40 μg/mL 和 100 μg/mL）樣品，每濃度進(jìn)行5次分析，結(jié)果計(jì)算方法的精密度RSD為2.1%，表明本方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性

取 1 號(hào)純牛奶樣品的制備液分別于 0、2、4、6、8、12、16、20、24 h測(cè)定，結(jié)果 RSD 為 1.5%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 回收率

取下面樣品各3份，每份分別加入一定量的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收率試驗(yàn)（n=3），結(jié)果見表7。

表7 回收率結(jié)果Table 7 Recovery results

1號(hào)純牛奶中四環(huán)素的回收率為92.26%，1號(hào)酸奶中四環(huán)素的回收率為91.83%，1號(hào)奶粉中四環(huán)素的回收率為89.75%，回收率結(jié)果令人滿意。

2.8 樣品測(cè)定結(jié)果

將15個(gè)樣品按照前處理方式制樣，然后將制備好的樣品溶液按照液相色譜分析測(cè)試條件進(jìn)樣，計(jì)算結(jié)果，如表8。

根據(jù)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》，廣譜抗菌獸藥在奶中的最高殘留量為0.1 mg/kg。

從表8可知，四環(huán)素的含量最高為3號(hào)酸奶，為0.152 9 mg/kg，最低的為2號(hào)奶粉，為0.016 45 mg/kg，超標(biāo)的有1號(hào)酸奶和3號(hào)奶粉，超標(biāo)的倍數(shù)分別為1.53和1.44，四環(huán)素藥物的超標(biāo)率為13.33%；

表8 含量測(cè)定結(jié)果Table 8 Content determination results mg/kg

金霉素的含量最高為1號(hào)牛奶，為0.331 7 mg/kg，最低的為1號(hào)酸奶，為0.010 94 mg/kg，超標(biāo)的有1號(hào)牛奶、2號(hào)牛奶、5號(hào)牛奶、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)酸奶、以及1、2、3 號(hào)奶粉，超標(biāo)的倍數(shù)分別為 3.32、2.98、2.96、2.10、3.3、2.1、1.07、1.36、1.62，金霉素藥物的超標(biāo)率為60.00%；

土霉素的含量最高為2號(hào)奶粉，為0.180 9 mg/kg，最低的為5號(hào)酸奶，為0.023 41 mg/kg，超標(biāo)的有5號(hào)牛奶、2號(hào)酸奶和2號(hào)奶粉，超標(biāo)的倍數(shù)分別為1.65、1.24和1.81，土霉素藥物的超標(biāo)率為20.0%；

多西環(huán)素的含量最高為5號(hào)牛奶，為0.2347mg/kg，最低的為2號(hào)牛奶，為0.019 05 mg/kg，超標(biāo)的有5號(hào)牛奶、1號(hào)酸奶、2號(hào)酸奶和2號(hào)奶粉，超標(biāo)的倍數(shù)分別為 2.35、1.12、1.53、1.65，多西環(huán)素藥物的超標(biāo)率為26.67%。

由上可知，超標(biāo)率最高的為金霉素高達(dá)60.00%，平均含量為0.151 9 mg/kg，其次為多西環(huán)素為26.67%，平均含量為0.084 35 mg/kg；土霉素為20.00%，平均含量為0.771 7 mg/kg；四環(huán)素為13.33%，平均含量為0.061 39 mg/kg。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超高效液相色譜法測(cè)定了牛奶及制品中的四環(huán)素類藥物殘留含量，結(jié)果四環(huán)素類藥物線性關(guān)系良好，RSD＜5%，實(shí)際樣品檢出率為100%，超標(biāo)率在13.33%～60.00%之間。此方法靈敏度高、操作快速、簡(jiǎn)便，回收率在89.75%～92.26%。此方法能為奶制食品中的四環(huán)素類獸藥殘留的檢測(cè)提供一些基礎(chǔ)的技術(shù)參數(shù)。四環(huán)素類藥物的累積對(duì)人身體的潛在危害較大。