大連市售鲅魚干化學及微生物指標分析

張雨晴，李穎，白婷婷，牟光慶，妥彥峰

（大連工業大學食品學院，遼寧大連116034）

隨著我國海產品消費市場的逐步擴大以及人民生活水平的提高和健康意識的加強，人們對海產品的安全越來越重視。現在，應用最廣泛的海產品保鮮的方法是低溫保鮮技術，但是單一的低溫保鮮技術存在著保鮮周期短、能耗高的各種問題，而腌制作為人們常用的水產品貯藏方法，卻鮮有研究。

鲅魚又被稱為馬鮫，類屬鲅科，體型細長扁平，具有銀色的體表。日常食用對治療一些病癥如營養不良、貧血、早衰、產后虛弱和神經衰弱等癥狀都會有一定的輔助治療功效[1]鲅魚干，顧名思義是將鲅魚腌漬后曬干而成的干制品。咸干鲅魚具有風味獨特、易于貯藏的特點，但目前加工方式仍以手工作坊式加工和自然晾曬為主，產品存在含鹽量高、風味不穩定等質量問題，因此需要對腌制魚的品質進行評價。王睿迪等[2]對咸鲅魚干品質的研究中發現揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量偏高，硫代巴比妥酸值（thiobarbituric acid，TBA）值為10.00 mg/kg，脂質氧化程度在感官可接受的范圍內。周星宇[3]在研究中發現另一種腌制魚類腌制鮐魚鹽度越高（8.27%），水分活度越低（0.874），越有利于樣品保藏。

傳統的水產品保藏方式腌制是在操作過程中加入食鹽，而一定程度的鹽分可以起到殺菌的作用。但是由于整個操作并不是在無菌環境中進行，很有可能在操作中帶入一些其他的微生物。要明確了解這種貯藏方式是否合理，我們需要檢測水產品在該種保藏方式之后的各項指標，如氨基酸態氮、酸價等指標從而確定鲅魚干是否適合人們食用。本試驗采集大連不同農貿市場銷售的鲅魚干，對其進行菌落總數、揮發性鹽基氮、pH值、脂肪氧化值、酸價、鹽分、水分的測定進而得出結論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料1（新鮮鲅魚）：大連某超市。原料2（制作后儲藏期短的新鮮鲅魚干）：大連莊河市。原料3（制作后儲藏期短的新鮮鲅魚干）：大連長興生鮮市場；原料4（制作后儲藏期較長的鲅魚干，即晾曬時間較長，水分含量較低的鲅魚干）：大連市辛寨子綜合市場。

本試驗所有鲅魚干均是由重量為800 g～1 500 g的新鮮鲅魚，由背部切開，去內臟和腮，在剖開的魚肉表面撒一層食鹽，室外自然晾曬而成。

平板計數瓊脂、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂：北京陸橋技術有限責任公司；蛋白胨：北京奧博星生物技術有限責任公司；氯化鎂：天津市科密歐化學試劑有限公司；硫酸鉀、鉻酸鉀：天津市光復科技發展有限公司；瓊脂：福建金燕海洋生物科技股份有限公司；丙三醇、無水碳酸鉀、硼酸、甲醇、氨水：天津市大茂化學試劑廠；2-硫代巴比妥酸：上海江萊生物科技有限公司；三氯乙酸、無水乙醚：國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸：北京化工廠；無水乙醇：天津市富宇精細化工有限公司；β-巰基乙醇：天津市福晨化學試劑廠；氫氧化鈉、氫氧化鉀：天津市東麗區天大化學試劑廠。

1.2 儀器設備

電子天平、pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；自動高壓滅菌器：日本拓美公司；電熱恒溫鼓風干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；電熱恒溫培養箱、電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；冷凍離心機：艾本德（中國）有限公司；全波長酶標儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；高效液相色譜：安捷倫科技有限公司；旋渦混合器：美國IKA。

1.3 方法

1.3.1 菌落總數及腐敗微生物菌落數的測定

根據夏秀東等[4]方法稍加修改進行測定。取4℃冷藏下的4種鲅魚原料，在無菌條件下各稱取5 g充分研磨加入10 mL無菌生理鹽水中，搖勻靜置，用無菌生理鹽水對上清進行10倍梯度稀釋，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋度的稀釋液。取 100 μL 適當稀釋度的稀釋液，在營養瓊脂平板上進行涂布，每個稀釋度3個平行，然后在適當溫度下培養，使其長出單菌落。

平板計數瓊脂培養基：稱取23.5 g培養基溶解于1 L蒸餾水中，121℃滅菌20 min后傾注平板。

Pseudomonades培養基：稱取20 g蛋白胨，1.4 g MgCl2，1 g硫酸鉀，13.6 g瓊脂，10 mL丙三醇溶于1 L蒸餾水中，121℃滅菌20 min后傾注平板。

結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養基：將41.6 g溶于1 L蒸餾水中，加熱煮沸滅菌，冷卻至50℃后傾注平板。測定鲅魚干中不同微生物的具體培養基和培養條件如表1。

表1 微生物的種類及具體培養基和培養條件Table 1 Types of microorganisms and specific media and culture conditions

1.3.2 揮發性鹽基氮（TVB-N）的測定

分別稱取本試驗中4種不同鲅魚原料3.00 g，加入30 mL去離子水中并振搖，混合均勻后浸漬30 min，離心（6 000 r/min，12 min，4℃）取上清，上清液置于4℃冰箱中冷藏備用。揮發性鹽基氮（TVB-N）根據GB 5009.228-2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》[5]中第三法：微量擴散法稍加修改進行測定。

1.3.3 pH值的測定

稱取攪碎的樣品10 g溶于100 mL蒸餾水中，振蕩搖勻后浸漬0.5 h后離心，取約50 mL上清液，用pH計測其pH值。

1.3.4 TBA的測定

參考Witte等[6]方法稍加修改進行測定。稱取4種不同鲅魚樣品1.00 g，攪碎后加入5 mL 0.02 mol/L的2-硫代巴比妥酸（TBA），沸水浴20 min，待溶液變成粉紅色后，在流水中進行冷卻，之后放入離心機中離心，離心條件為4℃，8 000 r/min，15 min。離心結束后在532 nm測上清液的吸光度，記錄吸光值，記為A532。TBA以每千克樣品中丙二醛的毫克數來表示，公式為：

1.3.5 酸價的測定

酸價的測定采用趙東豪等[7]的方法稍加修改進行測定。分別稱取本試驗中4種不同鲅魚原料5 g，將樣品攪碎，置于50 mL離心管中，加入15 mL乙醚-乙醇混合溶劑（2∶1，體積比），渦旋振蕩直至均勻，超聲提取20 min后，在4 500 r/min條件下離心分離5 min，取上清于錐形瓶中，用上述方法再提取殘渣2次，合并上清液后供測定使用。在提取溶液中加入2滴～3滴酚酞指示劑，當氫氧化鉀溶液滴定至粉紅色，10 s內不褪色即為終點，記錄所需的氫氧化鉀標準溶液的體積。樣品做3個平行，同時做一個空白對照。

氫氧化鉀溶液的標定：稱取0.3 g干燥值恒重的基準鄰苯二甲酸氫鉀，加入40 mL蒸餾水使之溶解，加入2滴酚酞指示劑，滴定至溶液呈粉紅色，30 s不褪色，即得到標定出氫氧化鉀的濃度。

酸價測定結果用公式為：

式中：V為所用氫氧化鉀標準溶液的體積，mL；c為所用氫氧化鉀標準溶液的準確濃度，mol/L；56.1為氫氧化鉀的摩爾質量，g/mol；m為試樣的質量，g。

1.3.6 鹽分的測定

鹽分的測定采用翟毓秀等[8]的方法稍加修改進行測定。

1.3.7 水分的測定

本試驗樣品中水分的測定用直接干燥法，參照GB5009.3-2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》[9]稍加修改進行測定。

1.3.8 氨基酸態氮的測定

氨基酸態氮通過鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）法測量。將本試驗中4種不同鲅魚原料打碎，稱取1.00 g溶于20 mL蒸餾水，調至pH值為4.6，在室溫下靜置30 min后離心，離心條件為3 000 r/min、30 min。取50 μL上清液，加入1 mL鄰苯二甲醛試劑，室溫反應2 min。在吸光度340 nm處測定吸光度。鄰苯二甲醛試劑A液：40 mg鄰苯二甲醛（OPA）與1 mL甲醇溶液混合。鄰苯二甲醛試劑B液：0.5 g十二烷基硫酸鈉與25 mL 0.1 mol/L硼酸溶液混合。在通風臺將A液與B液混合于50 mL容量瓶中，加入100 μL β-巰基乙醇，蒸餾水定容得到。

氨基酸標準曲線的測定：稱取1.00 g亮氨酸，溶于1 000 mL 蒸餾水中。梯度稀釋為 0、50、100、200、300、400、500 mg/L。吸取50 μL各濃度的標準溶液，其中加入1 mL鄰苯二甲醛試劑，室溫下反應2 min，在吸光度340 nm處測定吸光度，制作標準曲線。依據測得的魚肉中的吸光度代入標準曲線中計算樣品中氨基酸態氮的含量。

1.4 統計分析

試驗中所有試驗至少重復3次，方差分析及差異顯著性分析（p＜0.05）采用SPSS20.0統計分析軟件進行分析，圖表采用OriginPro 8.5進行繪制。

2 結果與討論

2.1 菌落總數及腐敗微生物菌落數

多數水產品都是由于身體表面或體內的微生物的存在而發生分解，分解到一定程度就變為了腐敗。當腐敗進行到自溶階段的后期，由于內源酶的存在，含氮物質的分解逐漸增多，細菌利用這些營養物質繁殖加快，多數國家都會對細菌菌落總數（totalviablecount，TVC）做出規定與劃分。細菌總數[10]指的是取1 g或1 mL食品，一定條件處理后培養所得細菌菌落的總數。微生物是引起多數水產品腐敗的主要因素之一，腐敗微生物的生長狀況反映了水產品的腐敗程度[11]。由于微生物的作用，魚體內的蛋白質和氨基酸等物質發生脫氨、脫羧反應或者被分解，而產生氨、胺類（腐胺、尸胺、組胺）、硫化氫以及吲哚類化合物，從而使魚體產生具有腐敗特征的臭味。因此，在貯藏過程中檢測魚肉腐敗微生物的動態變化可以很好地反映魚體的腐敗程度[12]。腌制魚類是通過控制鹽分、水分含量、貯藏條件等柵欄因素，抑制產品腐敗變質和細菌生長，達到延長產品貨架期的目的。為了保證腌制魚類在食用前的安全性，實時的測定不同貯藏條件下細菌總數的含量變化具有非常重要的現實意義[13]。不同樣品的菌落數見圖1。

圖1 不同樣品的菌落數Fig.1 Number of colonies in different samples

由圖1可知，4種原料魚中的菌落總數和假單胞菌菌落數具有顯著性差異。原料4中的總菌落數最多，為5.6 log CFU/g；原料2與原料3中的總菌落數無顯著性差異，且原料3的菌落數更多，這可能與處理方法有關；原料1鮮魚中的總菌落數為3.3 log CFU/g，在4種原料中數量最少，這與李婷婷[14]研究的大黃魚的初始菌落數接近，為2.9 log CFU/g，表明此時魚品質處于比較好的品質。與TVC值相比，特定腐敗菌的數量更能表征水產品的新鮮程度[15]假單胞菌作為腐敗菌，占菌落數目的大部分，說明假單胞菌是導致鲅魚腐敗的主要細菌。細菌總數≤106CFU/g為一級鮮度。結果表明4種原料菌落總數均小于106CFU/g，新鮮度為一級。

2.2 揮發性鹽基氮（TVB-N）

揮發性鹽基氮就是水產品在腐敗過程中，在微生物和酶的相互作用下，將魚肉中的蛋白質被分解生成氨和胺等堿性揮發性的含氮物質。TVB-N與水產品的腐爛存在著良好的相關性。而水產品的腐爛與菌落總數存在著良好的相關性，因而揮發性鹽基氮與菌落總數存在著良好的相關性。水產品腐爛的程度越大，揮發性鹽基氮的數值就越大，落總數也就越多。因此我們常常將揮發性鹽基氮也作為判斷水產品是否腐敗的重要指標之一。國家衛生標準GB 2733-2015《食品安全國家標準鮮、凍動物性水產品》規定海水魚TVBN的臨界值通常為不超過30 mg/100 g。不同樣品的揮發性鹽基氮含量見圖2。

圖2 不同樣品的揮發性鹽基氮含量Fig.2 Total volatile basic nitrogen content of different samples

如圖2所示，原料1 TVB-N值與其他3種原料具有顯著性差異，其中原料4的最高，達到132 mg/100 g，顯著高于其他3種原料TVB-N值，遠遠高于30 mg/100 g，為已降解不可食用的魚。說明存放較長時間后魚中蛋白質被降解，魚體內部氨基酸態氮和可溶性蛋白的濃度增高。原料1TVB-N值最小，為14.7 mg/100 g，小于 15 mg/100 g，為一級品[16]。

原料2和原料3的TVB-N值分別為24.0mg/100g，24.8 mg/100 g，TVB-N＜30 mg/100 g為二級品，無顯著性差異。

原料4的TVB-N遠遠高于30 mg/100 g，而原料1、原料2和原料3符合國家標準。原料4鲅魚干制作后儲藏時間較長，而且本研究發現魚干中微生物數目也遠遠大于制作后儲藏時間較短的魚干。魚肉中的微生物越多，其分解的蛋白質越多，蛋白質分解后產生的揮發性物質即TVB-N就越高。

2.3 pH值

Varlik等[17]指出pH影響自由氫離子和氫氧根離子的濃度，因此pH值的測定是常用的物理質量控制方法。水產品捕撈后，在糖原分解酶的作用下，糖原分解產生有機酸從而導致pH值下降，而后隨著微生物的繁殖及在內源酶的作用下，蛋白質分解為小分子胺類物質又使pH值上升[18]。因此，水產品貯藏過程中pH值的變化對水產品的新鮮度的變化也會起到一定程度的指示作用。pH值不同代表著新鮮度也不同，且pH值越大，其腐敗程度越大。pH值為5.5～6.8的為新鮮魚，pH值為6.9～7.0的為次鮮魚，pH值為7.1以上的為變質魚。

本試驗中4種不同鲅魚原料測得的pH值如圖3所示。

圖3 不同樣品的pH值Fig.3 pH of different samples

2.4 TBA

TBA值反應的是咸魚在貯藏過程中脂肪氧化產生的丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量。相同條件下，樣品中脂肪含量越高，脂肪氧化程度越大[12]。研究表明，乙醛和辛二酮與脂質氧化產生的刺激味之間有顯著的相關性，同時與硫代巴比妥酸法之間有很高的相關性，因此是以TBA評價水產品中脂質氧化的有效方式。TBA值越高，代表魚肉腐敗的程度越大。本試驗中4種鲅魚原料TBA如圖4所示。

2.5 酸價

酸價是衡量水產品油脂酸敗的重要指標。魚、蝦等水產品在加工、貯藏及運輸過程中，由于受氧、水、光、熱、酶和微生物等因素的作用，油脂逐漸水解或氧化而變質，使中性脂肪分解為游離脂肪酸而使酸價增高，或使脂肪酸形成過氧化物后再分解為低級脂肪酸、醛類和酮類等有害物質[19-20]，影響水產品中油脂貯藏的穩定性，危害人體健康。因此，測定水產品的酸價有助于判斷其油脂水解酸敗程度，從而鑒定水產品的品質[7]。

圖4 不同樣品的硫代巴比妥酸值Fig.4 Thiobarbituric Acid Values for Different Samples

圖5 不同樣品的酸價Fig.5 Acid values of different samples

從圖5可知，原料1、原料2、原料3、原料4的酸價各為 2.11、2.86、3.62、4.84 mg/g，從大到小的順序仍然為原料4、原料3、原料2、原料1。酸價小于40 mg/g為可食用，具有顯著性差異。從酸價這個指標來看，制作后儲藏時間短的鲅魚干與制作后儲藏時間長的鲅魚干都沒有變質，均可食用。

酸價從高到低依次為制作后儲藏時間較長的鲅魚干、制作后儲藏時間較短的鲅魚干和新鮮的鲅魚。數據出現上述問題一定是由于魚體內微生物的繁殖增多，微生物的作用使得油脂逐漸水解形成游離脂肪酸，從而造成魚肉的腐敗。

2.6 鹽分

鮮魚的水分活度約為0.99，一般來說，體內富含有水的食物往往它們的水分活度會大于0.85。水分活度較高的話，比較適宜細菌的生長和繁殖。因此，要想控制食物中病原體的生長繁殖，一般來說需要冷藏或者采取其他的措施。

鹽漬食物不但能夠抑制微生物的生長繁殖，而且還能給他們帶來新的風味與口感。鹽的防腐作用首要就是提升滲透壓，從而濃縮細胞質膜而發生質壁分離。不同微生物對食鹽濃度的適應性不同，具有差別，因而對鹽分進行測定是十分必要的。不同樣品中的鹽分如圖6所示。

圖6 不同樣品的鹽分Fig.6 Salinity of different samples

由圖6可知，原料1、原料2、原料3和原料4的鹽分分別為2.15%、17.28%、13.35%和10.53%。由此可見，原料2的魚中鹽分含量最大，除了原料1鮮魚，原料4所含鹽分最少。

鹽可以起到殺菌的作用，因此鹽分越高，食物中的微生物數目越少，分析與試驗得出的菌落數目結果相一致。

2.7 水分

魚肉在解凍過程中存在汁液流失的現象，最終導致魚肉在空氣中氧的作用下脂肪氧化酸敗，而且會使表面黃褐變，外觀變差，食味、風味、營養下降。水分含量的大量損失包含了大量營養物質的損失，影響食品口感。一定的水分含量可保持食品品質，延長食品保藏。4種原料中的的水分含量如圖7所示。含水量具有顯著性差異。原料1的水分含量最高，為70.09%，與蔡秋杏等[21]所測得的原料大黃魚中的水分含量68.28%接近；原料2、原料3、原料4的鲅魚含水量各為49.81%、52.45%和26.25%。其中原料1水分含量最多，說明在鮮魚的狀態下水分并沒有蒸發很多，原料4水分含量低是由于腌制階段鹽的脫水作用風干階段造成的。

圖7 不同樣品的水分Fig.7 Moisture of different samples

2.8 氨基酸態氮

本試驗選用的標準亮氨酸溶液濃度為0.5 mg/mL，繪制的亮氨酸溶液標準曲線如圖8所示。

圖8 氨基酸態氮的標準曲線Fig.8 Standard curve of amino acid nitrogen

由圖8可知亮氨酸溶液標準曲線方程為y=0.0153x+0.131。

取處理好的樣品測定其在340 nm處的吸光度，并帶入標準曲線方程中求得游離氨基酸含量如圖9所示。

圖9 不同樣品中的游離氨基酸含量Fig.9 Free amino acid content in different samples

由圖9可知原料1、原料2、原料3、原料4中的游離氨基酸含量分別為 0.70、0.99、1.27 mg/mL和2.58 mg/mL，原料1與原料3、原料4具有顯著性差異，大小關系仍然為原料4＞原料3＞原料2＞原料1。氨基酸態氮代表的是魚體內蛋白質的分解程度，游離氨基酸越多，說明魚肉分解越厲害，即腐敗程度越大。原料4腐敗程度最大，其次分別為原料3、原料2，最后為原料1。說明，存放時間越長，魚肉中的微生物越多，魚肉的腐敗程度越大，其中的游離氨基酸態氮越多。

3 結論

原料2、原料3均為制作后儲藏時間較短的鲅魚干，檢測之后各項指標均達要求，說明制作后儲藏時間較短的鲅魚干適宜人們食用；原料4為制作后儲藏時間較長的鲅魚干，檢測之后有個別指標不達標，比如揮發性鹽基氮顯著大于標準要求，所以制作后儲藏時間較長的鲅魚干不適宜人們食用。因此，腌漬這種保藏方式是可行的，并且制作后儲藏時間較短的鲅魚干是適宜人們食用的，制作后儲藏時間較長的鲅魚干而不宜食用。