響應(yīng)曲面優(yōu)化分心木中總皂苷的提取工藝

高涵，張麗姿，焦夢(mèng)悅，陸文靜，徐興華，田益玲，，*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000；2.河北?。ㄐ吓_(tái)）核桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北邢臺(tái)066600；3.河北省核桃工程技術(shù)研究中心，河北邢臺(tái)066600）

核桃分心木，別名隔心木，為核桃種內(nèi)隔膜，是胡桃科植物胡桃果核的干燥木質(zhì)隔膜、體輕、質(zhì)脆、易折斷。表面棕色至淺棕褐色，稍有光澤，邊緣不整齊，上中部有一卵圓形或橢圓形孔洞，長(zhǎng)約占隔膜直徑的1/2，邊緣增厚處呈棕褐色，增厚部分匯合延伸至基部[1]。分心木味苦、澀，性平，是促進(jìn)睡眠的一種中藥[2]。孫立梅等和王麗娟等[3-4]的研究表明酸棗仁提取物具有促進(jìn)睡眠的作用，黃維等[5]的研究表明酸棗仁中促進(jìn)睡眠的功效成分主要為皂苷。因此，分心木中促進(jìn)睡眠的成分可能與皂苷有關(guān)，但目前關(guān)于核桃分心木的研究，多集中在黃酮、多酚的提取[6-7]，與皂苷相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道少之又少。進(jìn)行核桃分心木中總皂苷的提取分離，將有利于核桃分心木的綜合開發(fā)和利用，并為后續(xù)分心木促進(jìn)睡眠成分的進(jìn)一步研究提供基本原料。

目前提取分心木中總皂苷的方法有溶劑浸提法，微波、超聲波和超高壓輔助提取法[8-9]，不同提取方法得到的總皂苷存在一定的差別。超聲波提取具有成本低、提取率高、能耗少、提取純度好等優(yōu)點(diǎn)[10]，就國(guó)內(nèi)外的報(bào)道來看，還未見對(duì)于超聲波提取過程詳細(xì)優(yōu)化的相關(guān)報(bào)道，故選擇此方法進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃分心木：河北綠嶺果業(yè)有限公司，經(jīng)河北大學(xué)職工醫(yī)學(xué)院鑒定；薯蕷皂苷對(duì)照品：北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、高氯酸、甲醇、冰乙酸、正丁醇、香草醛均為分析純：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；UV-2008H型紫外可見分光光度計(jì)：上海UNIC公司；HW·SY11型電熱恒溫水浴鍋：北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備及測(cè)定

參考文獻(xiàn)[11]并稍作調(diào)整，準(zhǔn)確稱取薯蕷皂苷0.001 8 g于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，備用。

分別吸取薯蕷皂苷對(duì)照品溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL置于25 mL具塞比色管中，水浴揮干溶劑，加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，再加入0.8 mL高氯酸，使殘?jiān)芙?，?0℃水浴加熱10 min，冰浴冷卻后，加入冰乙酸定容到5 mL，搖勻，460 nm測(cè)定吸光度值。

1.3.2 樣品溶液的制備及測(cè)定

參考文獻(xiàn)[12-13]并稍作調(diào)整，準(zhǔn)確稱取分心木粉末（過40目篩）1 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入不同體積、不同濃度的乙醇，用超聲波輔助提取一定時(shí)間，再用離心機(jī)以5 000 r/min速率離心15 min后取上清液5 mL，水浴蒸至無醇味后用蒸餾水溶解至5 mL，用分液漏斗進(jìn)行萃取，萃取劑為水飽和正丁醇。在已處理好的試樣中加入5 mL水飽和正丁醇，振搖萃取3次，取正丁醇層，合并3次的提取液，旋蒸蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至量瓶中，甲醇定容至5 mL，即得供試品溶液。

取1 mL的供試液按照1.3.1的方法顯色測(cè)定皂苷含量。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 乙醇濃度對(duì)皂苷提取率的影響

取分心木粉末1 g，分別加入不同濃度的乙醇溶液40%，50%、60%、70%、80%、95%、100%，液料比為20∶1（g/mL），超聲提取時(shí)間 3 min，按 1.3.1 步驟操作，于最大吸收波長(zhǎng)460 nm處測(cè)定吸光度，每組做3個(gè)平行試驗(yàn)。

1.3.3.2 提取時(shí)間對(duì)皂苷提取率的影響

取分心木粉末 1 g，分別提取 5、10、20、30、40 min，以70%濃度乙醇為提取劑，液料比為40∶1（mL/g）。按1.3.1步驟操作，于最大吸收波長(zhǎng)460 nm處測(cè)定吸光度，每組做3個(gè)平行試驗(yàn)。

1.3.3.3 液料比對(duì)皂苷提取率的影響

取分心木粉末1 g，分別用不同的液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g），以 70%濃度乙醇為提取劑，用超聲提取3 min。按1.3.1步驟操作，于最大吸收波長(zhǎng)460 nm處測(cè)定吸光度，每組做3個(gè)平行試驗(yàn)。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化分心木中皂苷提取工藝

根據(jù)Design-Expert8.0中Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比3個(gè)因素，分別以A、B、C表示，每一個(gè)自變量的低、中、高試驗(yàn)水平分別以-1，0，1進(jìn)行編碼，以皂苷提取率（Y）為響應(yīng)值。試驗(yàn)因素及水平編碼見表1。對(duì)各因素及響應(yīng)值進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，并對(duì)方程進(jìn)行方差分析，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

表1 設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1 Coded values and corresponding actual values in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

皂苷濃度（Y）與吸光度（X）之間的回歸方程為：Y=0.03X-6.45×10-4，R2=0.997 08，皂苷濃度在 0.000～0.030 g/L呈良好的線性關(guān)系。

2.2 分心木中皂苷提取單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對(duì)皂苷提取率的影響

乙醇濃度對(duì)皂苷提取率的影響如圖1所示。

圖1 乙醇濃度對(duì)皂苷提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of saponins

由圖1可知，當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)，分心木中皂苷提取率最大。當(dāng)乙醇濃度小于50%時(shí)，隨著乙醇濃度的增加，皂苷提取率增加；當(dāng)乙醇濃度大于50%時(shí)，皂苷提取率有不同趨勢(shì)的增加或減小，但都小于乙醇濃度為50%時(shí)的皂苷提取率。因此，乙醇濃度選取50%為宜。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)皂苷提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)皂苷提取率的影響如圖2所示。

圖2 提取時(shí)間對(duì)皂苷提取率的影響Fig.2 Effect of extracting time on the yield of saponins

由圖2可知，當(dāng)超聲時(shí)間為3 min時(shí)，分心木中皂苷的提取率最大，超聲時(shí)間略長(zhǎng)或略短，皂苷提取率有不同程度的增大或減小，但提取率均小于超聲時(shí)間為3 min時(shí)皂苷的提取率。另外，當(dāng)超聲時(shí)間為3 min左右時(shí)，皂苷提取率接近超聲時(shí)間為3 min時(shí)的提取率，故考慮成本與效率問題，超聲時(shí)間選取3 min為宜。

2.2.3 液料比對(duì)皂苷提取率的影響

液料比對(duì)皂苷提取率的影響如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)液料比為20∶1（mL/g）時(shí)，皂苷提取率最高。當(dāng)液料比小于20∶1（mL/g）時(shí)，皂苷提取率隨著液料比的增加而增加；當(dāng)液料比大于 20∶1（mL/g）時(shí)，皂苷提取率隨著液料比的增加反而減小。因此，選取液料比為20∶1（mL/g）為宜。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化分心木中皂苷提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。采用Design-Expert8.0軟件對(duì)各因素及響應(yīng)值進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，得二次多項(xiàng)回歸模型方程：Y=1.02＋0.12A＋0.047B－0.10C+0.13AB+0.37AC－0.14BC－0.03A2－0.11B2＋0.01C2－0.23A2B＋0.47A2C－0.26AB2。

圖3 液料比對(duì)皂苷提取率的影響Fig.3 Effect of ratio of solvent-solid on the yield of saponins

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.3.2 方差分析結(jié)果

對(duì)方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。由表3可知，模型F值37.47表明該模型是顯著的。回歸方程各項(xiàng)方差分析表明，乙醇濃度（A）、料液比（C）達(dá)顯著水平，提取時(shí)間（B）不顯著，且3個(gè)因素的總皂苷提取得率影響排序?yàn)锳（乙醇濃度）>C（料液比）>B（提取時(shí)間）。交互作用的等高線圖及三維響應(yīng)面圖見圖4至圖6，其曲線走勢(shì)的坡度越陡，說明該因素對(duì)分心木中皂苷的提取效果影響越顯著；坡度越平滑，影響則越小。乙醇濃度與提取時(shí)間（AB）作用顯著，乙醇濃度與料液比（AC）、提取時(shí)間與料液比（BC）交互作用均表現(xiàn)為極顯著水平，與方差分析結(jié)果相一致。模型的P值遠(yuǎn)小于0.01，表現(xiàn)為極顯著，該模型的R2=0.991 2，表明模型充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.4 最佳條件和驗(yàn)證試驗(yàn)

通過軟件Design-Expert8.0求解方程，對(duì)回歸方程進(jìn)行分析處理，獲得最佳提取條件為乙醇濃度60%，超聲時(shí)間 2.75 min，料液比 1∶25（g/mL），核桃分心木總皂苷提取率的預(yù)測(cè)值為1.88%?？紤]到實(shí)際操作的可行性，對(duì)此提取工藝條件進(jìn)行改善為乙醇濃度60%，超聲時(shí)間3min，料液比1∶25（g/mL）。為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可靠性，在優(yōu)化條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，測(cè)得核桃分心木總皂苷平均提取率為1.86%，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)的結(jié)果1.88%非常接近，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值很好的吻合。

表3 回歸與方差分析結(jié)果Table 3 Regression and ANOVA table of variable

圖4 乙醇濃度和提取時(shí)間交互作用響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plotsof ethanol concentration andextracting time on the extraction rate ofsaponins

圖5 乙醇濃度和料液比交互作用響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plotsof ethanol concentration andsolvent-solidratioon the extraction rate ofsaponins

圖6 提取時(shí)間和料液比交互作用響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plotsof extracting time andsolvent-solidratioon the extraction rate ofsaponins

3 結(jié)論

該研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Design-Expert8.0軟件采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法對(duì)核桃分心木中皂苷的提取工藝進(jìn)行設(shè)計(jì)并優(yōu)化。本試驗(yàn)比較了乙醇濃度、超聲時(shí)間和液料比3個(gè)因素的影響。確定核桃分心木中皂苷的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度 60%，超聲時(shí)間 3 min，料液比 1∶25（g/mL），實(shí)際測(cè)得分心木中皂苷的提取率為1.86%，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果相接近，說明此優(yōu)化工藝參數(shù)可靠。

朱青梅等[11]采用乙醇回流法提取新疆核桃分心木中的皂苷，提取時(shí)間為2 h。超聲波輔助提取則大大縮短提取時(shí)間，減少了能源與時(shí)間的消耗，具有用時(shí)短、效率高等優(yōu)點(diǎn)，綜合考慮，超聲波輔助提取可以得到推廣。