改良QuEChERS結合高效液相色譜-串聯質譜法檢測飼料中的7種鎮靜劑

張 虹， 何曉明

（1.浙江財經大學會計學院，浙江杭州 310018；2.綠城農科檢測技術有限公司，浙江杭州 310052）

鎮靜劑是指對中樞神經系統產生抑制作用，減弱其生理機能從而緩和激動、消除躁動、恢復安靜情緒的藥物（魏晉梅等，2016）。近年來，個別畜牧業飼養者在飼養過程中將鎮靜劑添加至動物飼料中以達到鎮靜催眠、快速催肥和縮短出欄時間的目的。此外，在動物運輸、檢疫、屠宰前，也常使用此類藥物以減少應激帶來的損失（張爍等，2014）。有研究表明，殘留在動物體內的鎮靜劑會隨著食物鏈進入人體內，對人體中樞神經系統造成不良反應（嚴麗娟等，2013）。目前，我國明確規定在動物養殖過程中嚴禁添加鎮靜劑類藥物（中華人民共和國農業部，2002）。因此，建立一種快速、高效、靈敏的飼料中多種鎮靜劑的監測方法對確保食品動物質量安全具有重要意義。

目前，鎮靜劑檢測方法主要包括酶聯免疫法（ELISA）（李桂敏等，2014；孫文佳等，2012）、氣相色譜-質譜法（GC-MS）（汪麗萍等，2005）、液相色譜法（HPLC）（羅慧玉等，2017）和高效液相色譜-串聯質譜法 （HPLC-MS/MS）（孫珊珊等，2018；劉家陽等，2017；朱群英等，2016）。 其中 HPLC-MS/MS法靈敏度高、選擇性和抗干擾能力強，成為最常用的檢測方法。

由于飼料基質復雜，易對分析造成干擾。現有的國標方法與文獻報道多采用固相萃取法對樣品進行凈化處理，雖然結果重現性好，但存在操作繁瑣、處理時間長、成本高等問題。QuEChERS前處理方法具有快速、簡單、廉價、有效、可靠、安全的特點，已被廣泛用于獸藥殘留分析（Xu等，2018；田海偉等，2017；劉永濤等，2017）。本實驗采用增強型去除脂類基質吸附劑（EMR-Lipid）對飼料樣品進行凈化，旨在建立飼料中7種鎮靜劑的測定方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑 LC-MS/MS 8050三重四級桿液相色譜-串聯質譜儀 （日本Shimadzu公司）；ST16R高速冷凍離心機 （美國Thermo公司）；Multi Reax全能型振蕩器 （德國Heidolph公司）；R215旋轉蒸發儀 （瑞士Buchi公司）；Milli-Q Reference超純水機（美國Millipore公司）。

甲酸、乙腈和甲醇（HPLC級，美國Thermo公司）；EMR-Lipid（美國 Agilent公司）；石墨化炭黑（GCB）、C18 及 N-丙基乙二胺（PSA）（天津博納艾杰爾科技有限公司）；實驗用水為Milli-Q超純水；其他試劑均為國產分析純試劑。

氯丙嗪（純度99.2%，德國 Dr.Ehrenstorfer公司）；地西泮、艾司唑侖、咪達唑侖、安眠酮、塞拉嗪、利血平（純度均大于95%，美國CerilliaIlt公司公司）。

1.2 標準儲備液的配制 用甲醇分別配制7種鎮靜劑標準品的10 mg/L的單標準儲備溶液，于4℃下避光保存。用時根據需要用空白基質提取液逐級稀釋配成適當濃度的混合標準工作液。

1.3 樣品前處理 飼料樣品經粉碎均勻后制成待測樣，于室溫下密封保存。稱取2.0 g待測樣品于50 mL聚乙烯離心管中，加入10 mL超純水，渦旋振蕩1 min后，加入2.0 g EMR-lipid和10 mL乙腈，渦旋振蕩10 min，再加入4.0 g無水硫酸鈉和1.0 g氯化鈉，渦旋振蕩2 min，8000 r/min高速冷凍離心3 min。 取上清液約8 mL置于裝有100 mg C18、50 mg PSA和200 mg無水硫酸鈉的15 mL離心管中，渦旋振蕩2 min，8000 r/min高速冷凍離心3 min。取5 mL上清液至10 mL試管中，40℃氮吹至干，用1 mL初始濃度流動相復溶，經0.22μm濾膜過濾后，上機測定。

1.4 測定方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.35 mL/min；進樣量：2 μL；流動相：A 相為 0.1%甲酸水溶液，B相為0.1%甲酸甲醇溶液；梯度順序：0 ～ 0.5 min，10%B；0.5 ～ 2.5 min，10% ～ 25%B；2.5 ～ 5.0 min，25% ～ 95%B；5.0 ～ 6.0 min，95%B；6.0 ～ 6.5 min，95% ～ 10%B。

1.4.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）：正離子模式；溫度：400℃；毛細管電壓：4000 V；霧化氣流量：3.0 L/min；加熱氣流量：10.0 L/min；定性與定量離子對、碰撞能量等參數見表1。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化 7種鎮靜劑均屬于弱堿性化合物，因此選擇在正離子模式下對目標物進行質譜條件的優化。分別采用全掃描和子離子掃描方式優化得到了母離子、子離子及各自的質譜參數。根據EU第657/2002/EC號決議中有關規定中有關質譜分析方法必須不少于4個識別點的規定，選擇兩對質譜響應最佳的監測離子對及相應參數作為最終質譜采集參數，優化的質譜條件見表1。

表1 7種鎮靜劑的質譜參數

2.2 色譜條件優化 本實驗考察了甲醇-水和乙腈-水2種流動相體系在相同梯度洗脫條件下，對7種鎮靜劑的分離度、靈敏度和峰型的影響。使用甲醇-水體系時能獲得較好的分離效果和儀器響應。考慮到目標均采用正離子模式，比較了在流動相中加入不同濃度甲酸溶液對色譜分離和質譜響應的影響。結果發現，加入0.1%的甲酸后各目標物的質譜響應有顯著提高，峰型也較好，與孫珊珊等（2018）報道結果相似。最終選用0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水作為流動相，在優化的條件下7種鎮靜劑總離子流圖見圖1。

圖 1 7 種鎮靜劑（5 μg/L）的總離子流（TIC）色譜圖

2.3 提取條件優化

2.3.1 提取條件的優化 獸藥殘留檢測常用的提取試劑有甲醇、乙腈、乙酸乙酯等。甲醇能與水互溶，鹽析效果不佳。本實驗比較乙腈與乙酸乙酯2種提取試劑對7種鎮靜劑的的提取效果。結果表明，兩者提取效果相當，但考慮到飼料樣品中蛋白質含量較高，乙腈具有沉淀蛋白質的作用，能在一定程度上減少基質效應，因此選擇乙腈作為提取試劑。

飼料樣品中含有較多的脂肪，在提取過程中會被一起提取出來，不利于QuEChERS的凈化。參考李詩言等（2017）的方法，在鹽析提取前加入EMR-Lipid用于除去樣品中的脂類物質，可有效提高凈化效率。實驗考察了EMR-Lipid添加量為0.5、1.0、2.0、3.0 g 時對樣品的凈化效果（圖 2），結果表明，當EMR-Lipid添加量為2 g時，即可滿足實驗要求。

圖2 EMR-Lipid添加量對7種鎮靜劑回收率的影響

2.3.2 凈化條件的優化 采用乙腈和EMR-Lipid雖然去除樣品中大部分的蛋白質和脂類物質，但是提取液中還殘留少量脂肪和色素等干擾組分需進一步凈化。本實驗采用QuEChERS法對樣品提取液進行進一步凈化。QuEChERS法常用吸附劑有GCB、C18及PSA。GCB對色素去除效果較好，但對具有平面結構的目標物也有較強的吸附作用，所以不予考慮；C18具有良好的除脂能力；PSA可有效去除色素和糖類。本實驗考察PSA和C18的最佳使用量 （圖3）。結果顯示，采用100 mg C18、50 mg PSA及200 mg無水硫酸鈉為凈化劑組合時，樣品可以獲得良好的凈化效果，基質干擾小，且不會對目標物產生明顯吸附。

圖3 不同凈化劑組合對7種鎮靜劑回收率的影響

2.4 基質效應 基質效應在液相色譜-串聯質譜分析中普遍存在，是基質成分和目標物在電噴霧離子源進行離子化時相互競爭所致 （周悅榕等，2017）。分別配制濃度為空白飼料基質匹配標準曲線以及對應質量濃度的純溶劑標準曲線，通過兩者的斜率比值評價基質效應。由表2可知，7種鎮靜劑斜率為0.583～0.801，說明雖然經過凈化，但由于飼料基質復雜，部分目標物仍存在較強的基質抑制作用。因此本方法仍采用基質匹配標準曲線法進行校正補償，以消除基質效應對檢測的干擾。

表2 7種鎮靜劑的線性方程、回歸方程、相關系數和定量限

2.5 線性范圍和定量限 用空白飼料樣品基質提取液配制7種鎮靜劑的系列混合標準溶液，在優化的實驗方法下進行測定，以目標物定量離子的峰面積為縱坐標（y），質量濃度為橫坐標（x），繪制標準曲線。結果表明，7種鎮靜劑線性關系良好，相關系數均≥0.99。

同時，以3倍信噪比確定目標物的檢出限（LOD）為 1.1～2.8μg/kg，以 10倍信噪比確定目標物的定量限（LOQ）為3.7～9.3μg/kg。

2.6 回收率與精密度 選取空白配合飼料、濃縮飼料和預混合飼料樣品分別添加高、中、低3個水平的混合標準溶液，每個水平平行測定6次。結果如表3所示，7種鎮靜劑平均回收率為84.7%～96.5%，相對標準偏差為3.2% ～10.8%，滿足GB/T 27404-2008中食品中禁用物質質量分數＜0.1 mg/kg時，回收率為60%～120%的規定（中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，2008）。

表3 空白樣品中7種鎮靜劑的回收率和相對標準偏差（n=6）

2.7 與其他方法的比較 與現行國標方法和相關文獻報道方法（孫珊珊等，2018；中華人民共和國農業部，2007）相比，本文建立的前處理以EMR-Lipid為吸附劑的QuEChERS方法可直接凈化提取液，有效吸附飼料中脂溶性雜質，省去了柱活化、上樣、淋洗再洗脫的SPE過程，操作簡單快速、溶劑用量小、檢測成本低，適用于大批量樣品快速檢測。。

2.8 實際樣品的分析 分別對日常送檢的配合飼料、濃縮飼料和預混飼料各10份進行7種鎮靜劑殘留的檢測，結果表明，所有飼料樣品均未發現這7種鎮靜劑。

3 結論

本實驗將吸附劑EMR-Lipid應用到QuECh-ERS方法中，并結合HPLC-MS/MS建立了飼料中7種鎮靜劑的快速檢測方法。結果表明，該方法簡單方便、靈敏度高、準確，能滿足飼料中7種鎮靜劑的檢測要求，對于其他鎮靜劑類藥物也具有較高的參考價值。