急性肝衰竭小鼠necroptosis的發(fā)生及Nec-1的干預(yù)作用研究

趙攀，楊昊臻，高雪，段鋒，陳婧，劉歆穎，徐軍

急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)主要以凝血異常和肝性腦病為臨床特征[1]，發(fā)病快、進(jìn)展迅速、預(yù)后差、病死率極高[2]。肝移植是目前內(nèi)科保守治療失敗時(shí)惟一有效的救治方式，但ALF的發(fā)病急驟、肝源短缺導(dǎo)致我國(guó)ALF的肝移植率極低。故此，研究ALF的發(fā)病機(jī)制就顯得相當(dāng)重要，旨在促進(jìn)全新且有效的內(nèi)科治療方法的產(chǎn)生[3]，從而改善ALF的預(yù)后并降低ALF相關(guān)的肝移植率和病死率。

ALF的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，最明顯的病理學(xué)特征是大量肝細(xì)胞的死亡[4-5]。程序性壞死(necroptosis)是近幾年被發(fā)現(xiàn)和描述的一種不依賴于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)激活的細(xì)胞程序性死亡方式，由受體相互作用蛋白(receptor-interacting protein, RIP)介導(dǎo)且可被程序性壞死特異性抑制劑-1(necrostatin-1, Nec-1)所抑制。雖然程序性壞死與凋亡有共同的上游分子機(jī)制，但是兩者結(jié)果不同。程序性壞死的最終結(jié)果是線粒體功能障礙，細(xì)胞器及細(xì)胞腫脹破裂，質(zhì)膜透化，細(xì)胞內(nèi)含物漏出，周圍組織產(chǎn)生炎性反應(yīng)[6-7]。與凋亡相區(qū)別的是，程序性壞死不影響核固縮，不產(chǎn)生核小體DNA片段。 現(xiàn)探討程序性壞死在ALF發(fā)病中的作用機(jī)制并觀察Nec-1對(duì)ALF預(yù)后的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動(dòng)物來源：SPF級(jí)雄性C57/BL6小鼠60只(購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，6～7周齡，體質(zhì)量20～25 g，室溫飼養(yǎng)，飼料為普通動(dòng)物飼料。(2)試劑試藥：受體相互作用蛋白-1(RIPl)、受體相互作用蛋白-3(RIP3)、β-actin購自Santa公司，均為兔抗來源，稀釋比例分別為1∶400、1∶500、1∶1 000；Nec-1、甘氨酸、過硫酸胺(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、Tris-HCl、SDS、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰、Tween-20、麗春紅染色液、二甲基亞砜(DMSO)、D-半乳糖胺(D-GalN)、脂多糖(LPS)均購自Sigma公司，D-半乳糖胺(D-GalN)和脂多糖(LPS)均使用無菌等滲鹽水溶解，分別配置成D-GaIN 100 mg/ml，LPS 1 mg/ml原液并分裝保存。(3)儀器設(shè)備：PCR儀(Thermo Electron Corporation生產(chǎn))、離心機(jī)(Thermo Electron Corporation生產(chǎn))、旋渦混合器(海門市麒麟醫(yī)用儀器廠生產(chǎn))、生化分析檢測(cè)儀(美國(guó)Beckman Coulter公司生產(chǎn))、電泳儀(Major Science生產(chǎn))等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2017年6月—2018年3月在解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。小鼠以隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組20只：模型組，D-GalN 350 mg/kg和LPS 30 μg/kg腹腔注射造模；對(duì)照組，腹腔注射與模型組等體積無菌生理鹽水；干預(yù)組，造模方法同模型組，造模前10 min給予Necrostatin-1 20 mg/kg溶于二甲基亞砜(DMSO)；各組分別于注射后(干預(yù)組于造模后)1 h、2h、3h斷頸處死小鼠，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只，留血并取小鼠肝左葉浸入4%多聚甲醛，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度5 μm，蘇木素—伊紅(HE)染色，由一位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師對(duì)肝組織病理學(xué)變化進(jìn)行評(píng)估。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 血清ALT及炎性因子檢測(cè)：小鼠血清ALT采用Beckman全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀進(jìn)行測(cè)定，血清TNF-α、IL-6、IL-10采用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 RIP檢測(cè)：(1)取小鼠肝組織20 mg，每10 mg組織加入組織蛋白裂解液100 μl,用玻璃研磨器于冰上勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5 ml EP管中，置于冰上15 min，以充分裂解。4℃，12 000 r/min離心10 min。將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到0.5 ml的離心管中，-20℃凍存。(2)將BCA試劑A和BCA試劑B以50∶1配制適量BCA工作液，充分混勻。完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取10 μl稀釋至100 μl，終濃度為0.5 mg/ml。將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、 2、 4、 8、 12、 16、 20 μl加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加入用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的溶液并補(bǔ)足到20 μl。加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中，加入用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的溶液并補(bǔ)足到20 μl。各孔加入BCA工作液200 μl，37℃放置30 min。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。(3)配膠電泳，待溴酚藍(lán)電泳至膠底部時(shí)終止電泳。(4)PVDF膜先在甲醇中浸濕，然后與濾紙一起放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中，至完全浸透，轉(zhuǎn)膜60 min。轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜取出放入TBS-T中清洗5 min。用TBST配制5%脫脂奶粉，將膜浸入后，室溫放置1 h。(5)用封閉液將一抗按照一定比例稀釋，RIP1(Santa Cruz Biotechnology提供)按1∶400；RIP3(Santa Cruz Biotechnology提供)按1∶500；β-actin(Cell Signaling Technology提供)按1∶1 000，將膜與一抗一起孵育，4℃過夜。孵育結(jié)束，TBS-T清洗3次，每次5 min。(6)用封閉液稀釋HRP標(biāo)記的二抗(羊抗兔IgG，Santa Cruz Biotechnology提供)，稀釋比例1∶10 000，將稀釋后的二抗與膜共同孵育1 h。孵育結(jié)束，TBS-T洗3次，每次5 min。(7)ECL曝光，將顯色后的膜掃描，用IPP6軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1 血清ALT及炎性因子比較 與對(duì)照組比較，造模后1 h模型組小鼠ALT、TNF-α、IL-6、IL-10均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。干預(yù)組ALT、TNF-α、IL-6、IL-10均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2 肝組織RIP1和RIP3表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，造模后1 h模型組小鼠肝組織RIP1和RIP3的表達(dá)明顯升高(t=5.867，P<0.001；t=4.388，P=0.002)；與模型組比較，干預(yù)組RIP3的1 h、2 h、3 h表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，RIP1在1 h和2 h水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但其3 h的水平低于模型組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.416,P=0.041)。見圖1、2。

表1 不同組別小鼠血清ALT及炎性因子比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

圖1 各組小鼠肝組織RIP1表達(dá)情況(標(biāo)示值為均值)

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

圖2 各組小鼠肝組織RIP3表達(dá)情況(標(biāo)示值為均值)

2.3 小鼠肝組織病理變化 造模后1 h、2 h、3 h，模型組小鼠的病理變化隨時(shí)間遞進(jìn)而加重，3 h肝細(xì)胞腫脹明顯伴有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，而干預(yù)組3 h的病變程度明顯好于模型組。圖3見封3。

3 討 論

課題組成員前期進(jìn)行了D-GalN和LPS造模的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，在模型的優(yōu)化方面積累了較好的經(jīng)驗(yàn)[8]。D-GalN是一種肝毒性藥物，通過半乳糖途徑代謝并消耗該途徑的中間代謝產(chǎn)物尿苷二磷酸，進(jìn)而抑制尿嘧啶核苷的代謝，導(dǎo)致核蛋白質(zhì)合成受阻，引起肝細(xì)胞損傷。LPS是革蘭陰性菌胞壁成分，可引起細(xì)胞吞噬功能障礙，導(dǎo)致血漿內(nèi)毒素水平升高，進(jìn)一步誘發(fā)肝衰竭[9]。

ALF的病死率極高，除外其發(fā)病急驟的特征外，缺乏有效的內(nèi)科治療是造成ALF病死率居高不下的最主要原因[10-12]。隨著necroptosis被新近發(fā)現(xiàn)并在多種器官疾病的發(fā)病機(jī)制中得到深入研究，necroptosis與肝臟疾病的聯(lián)系開始受到關(guān)注[13]。Gautheron等[14]的報(bào)道顯示，RIP3依賴的necroptosis調(diào)控非酒精性脂肪性肝炎誘導(dǎo)的肝纖維化，并預(yù)測(cè)這一通路很可能啟示新的和特定的非酒精性脂肪性肝炎藥物治療策略的產(chǎn)生。Roychowdhury等[15]的研究表明，小鼠RIP3的缺失可防止乙醇誘導(dǎo)的肝損傷。Li等[16]的研究顯示，選擇性抑制RIP3可緩解對(duì)乙酰氨基酚引起的肝損傷。

雖然necroptosis與上述肝臟疾病的關(guān)系已有所闡述，但其在ALF中的機(jī)制探討非常少見。Takemoto等[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Nec-1可以拮抗necroptosis過程中ROS誘導(dǎo)的肝臟毒性，對(duì)乙酰氨基酚引起的ALF有防護(hù)作用。本結(jié)果顯示，RIP1和RIP3蛋白在急性肝衰竭小鼠的肝臟中表達(dá)顯著升高，表明急性肝損傷時(shí)necroptosis明顯發(fā)生，但具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究[18-19]。此外，作為necroptosis的特異性抑制因子，Dec-1對(duì)降低肝損傷時(shí)的ALT和相關(guān)炎性因子水平具有較好效果，值得進(jìn)行深入研究。

本實(shí)驗(yàn)在造模后1 h，模型組ALT、TNF-α、IL-6、IL-10、RIP1、RIP3較對(duì)照組顯著升高，標(biāo)志造模成功，necroptosis發(fā)生；干預(yù)組與模型組比較，相關(guān)指標(biāo)降低明顯，表明Nec-1對(duì)ALF時(shí)發(fā)生的necroptosis有顯著改善作用，而且肝臟病理組織評(píng)估結(jié)果亦有改善。該研究發(fā)現(xiàn)與Takemoto等[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致，表明急性肝損傷時(shí)有necroptosis的發(fā)生，特異性抑制劑Nec-1可以改善ALF的病變進(jìn)展。

本研究未對(duì)動(dòng)物的生存率進(jìn)行觀察，是本研究的局限性所在。但是，本研究論證了程序性壞死在急性肝衰竭中的發(fā)生情況并觀察了程序性壞死特異性抑制劑-1對(duì)肝細(xì)胞程序性壞死的抑制作用，達(dá)到了先期的既定目標(biāo)，為進(jìn)一步明確急性肝衰竭的發(fā)病機(jī)制及開發(fā)新的治療策略提供了數(shù)據(jù)支持和參考。

利益沖突：無

作者貢獻(xiàn)聲明

趙攀：研究設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)分析，文獻(xiàn)調(diào)研，論文撰寫，論文終審；楊昊臻：研究設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)實(shí)施，論文修改；高雪：數(shù)據(jù)分析，論文修改；段鋒：實(shí)驗(yàn)實(shí)施，論文終審；陳婧：數(shù)據(jù)分析，論文終審；劉歆穎：實(shí)驗(yàn)實(shí)施，論文修改；徐軍：實(shí)驗(yàn)實(shí)施，論文修改