藏豬腹瀉物中細菌的分離鑒定及藥敏試驗

彭青，李榮麗，湯佩琦，葉兵兵

（四川民族學院農學院，四川 康定 626001）

藏豬是世界上少有的高原型豬種，是我國寶貴的地方品種資源，主要分布于四川、甘肅、云南、西藏、青海等高寒地區[1]。藏豬生活在高海拔地區，能夠適應惡劣的氣候環境，具有耐寒冷、抗病能力強、耐粗飼等特點，其肉質鮮美，具有很好的市場前景。隨著藏豬人工養殖的擴大，一些細菌性疾病越來越突出，腹瀉就是影響藏豬生長發育的重要因素之一。本文筆者及其團隊對甘孜州畜科所及當地農戶飼養的藏豬腹瀉物進行了細菌的分離鑒定及藥敏試驗，為藏豬腹瀉的有效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料采集 在甘孜州康定地區藏豬保種場及當地農戶無菌采集藏豬腹瀉物樣本30份。

1.2 試劑 營養瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基、普通肉湯培養基、MH瓊脂培養基、瓊脂糖、革蘭氏染劑、細菌DNA試劑提取盒、27F和14R上下游引物、Mix、ddH2O、藥敏試劑片等，均購自成都某生物科技有限公司。

1.3 儀器 恒溫培養箱、恒溫振蕩箱、臺式離心機、PCR基因擴增儀、電泳儀、光學顯微鏡等。

1.4 試驗方法

1.4.1 細菌分離 在超凈工作臺上，將采集來的腹瀉病料接種于營養肉湯培養基中，在37℃恒溫振蕩箱中增菌培養18～24h；用平板劃線法將擴增菌液分別接種到營養瓊脂培養基和麥康凱瓊脂培養基上，并編號；接種完成后將培養基置于37℃恒溫培養箱中培養18～24h；根據菌落形態及顏色特點分離純化培養24h。

1.4.2 鏡檢 挑取分離純化的單個菌落進行革蘭氏染色、鏡檢。

1.4.3 細菌DNA模板制備 將純化后的細菌接種于營養肉湯培養基中，在37℃恒溫振蕩箱中培養18～24h，將培養得到的菌液用細菌DNA提取試劑盒提取細菌的DNA。

1.4.4 PCR 擴增 取 ddH2O 3.2 μL，Mix 5 μL，27F和14R上下游引物各0.4μL，細菌DNA 1μL，共10μL進行PCR擴增。擴增條件：94℃預變性4 min；94℃變性 50 s、56℃退火 45 s、72℃延伸1 min，共30個循環；最后72℃延伸10min。取反應產物1μL用瓊脂糖凝膠電泳，經EB染色后置于紫外燈下觀察并拍照。

1.4.5 藥敏試驗 將分離得到的混合菌株采用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗：用無菌鑷子依次將藥敏試劑片貼于MH瓊脂培養基上，并做好標記；然后放在37℃恒溫培養箱中培養24 h，測量抑菌圈的直徑[2]。

2 結果與分析

2.1 細菌生長情況 在麥康凱瓊脂培養基上普遍存在兩種菌落，分別是紅色或粉紅色、圓形、表面光滑的菌落和透明或半透明的圓形菌落。如圖1所示。

2.2 鏡檢結果 在10×100倍油鏡下觀察可見兩端鈍圓的革蘭氏陰性短小桿菌，有的呈多種形態，散在或成對排列（見圖2），可初步鑒定為大腸桿菌和變形桿菌[3]。

2.3 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果 見圖3。

圖1 細菌生長情況

圖2 鏡檢結果

圖3 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果

表1 混合菌藥敏試驗結果

2.4 藥敏試驗結果 由表1可知，混合菌對頭孢曲松極度敏感，對丁胺卡那霉素高度敏感，對恩諾沙星、新霉素、氟苯尼考、慶大霉素、強力霉素、四環素低度敏感，對復方新諾明、鏈霉素、氨芐西林、青霉素有耐藥。

3 小結

3.1 本試驗通過對藏豬腹瀉物進行細菌分離、培養、鏡檢、PCR測序，得到腹瀉物中的細菌主要是大腸桿菌和變形桿菌。

3.2 藥敏試驗表明，混合菌對頭孢曲松極度敏感，對丁胺卡那霉素高度敏感，對恩諾沙星、新霉素、氟苯尼考、慶大霉素、強力霉素、四環素低度敏感，對復方新諾明、鏈霉素、氨芐西林、青霉素有耐藥。故在臨床防治時應避免使用復方新諾明、鏈霉素、氨芐西林、青霉素這類的抗生素，適當性使用頭孢曲松、丁胺卡那霉素，并且交替使用不同的抗生素以免耐藥。

3.3 由于試驗時間、空間等的限制，本次采集的樣本較少，不能代表本地區的所有情況，若要說明本地區的整體情況，還需采集更多的樣本進行進一步研究。本試驗結果僅供參考，不可作為臨床用藥的依據。