聚肌胞苷酸對氧糖剝奪損傷星形膠質細胞TLR3信號通路的影響

龔 軍 路翔宇 熊 偉 許 建 張 浩 俞小炯

（四川省醫學科學院·四川省人民醫院肝膽胰外 四川 成都 610072）

聚肌胞苷酸（polyinosinic polycytidylic acid，Poly I：C）為Toll樣受體3（TLR3）的特異性配體，且TLR3對TRIF依賴性信號通路專一介導。大量研究發現[1-4]，TLR3的特異性激動劑Poly I：C在體內外對缺血缺氧的神經細胞均有保護作用。研究發現[5-8]，Poly I：C對腦缺血損傷小鼠的神經細胞具有保護作用，并且可增加腦缺血小鼠及體外氧糖剝奪損傷處理的星形膠質細胞TLR3-TRIF信號通路下游IFN-3的表達起到抑制炎癥反應的作用。但現階段尚未明確其具體作用機制，因此本研究采用Western blot檢測氧糖剝奪損傷星形膠質細胞模型TLR3信號通路中的相關蛋白質表達的變化，進一步探討Poly I：C對神經細胞的保護作用機制。

1.材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

SD乳鼠，購自于凱學生物科技（上海）有限公司。Poly I：C（購自于上海玉博生物科技有限公司），TRIF、TLR3一抗（購自于上海研盟生物工程有限公司），pIRF3、NF-KB一抗（購自于上海滬震實業有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 于超凈工作臺取出生1d SD大鼠大腦皮質組織，在DMEM/F12青霉素小瓶中剪成1mm3的組織塊，加入等體積的0.25%胰蛋白酶37℃消化5min，后加入含20%胎牛血清的完全培養液終止消化。液體采用200目濾網過濾，離心去上清，沉淀細胞接種于完全培養液中，在傳代6次后即可使用。

1.2.2 實驗分組和模型建立 分為對照組、氧糖剝奪組（OGD）、Poly I：C（10、20ug/ml）、預適應組（Poly I：C+OGD）。取第6代細胞按照分組分別采用DMEM或Poly I：C與DMEM孵育24h，對照組使用有糖培養基培養，其余各組采用無糖培養基培養。培養12h后進行指標檢測。

1.2.3 Western blot檢測TLR3、pIRF3、pNF-KB表達 在各組細胞中加入80ul的含有蛋白酶抑制劑、磷酸化蛋白酶抑制劑的低溫蛋白裂解液，4℃處理0.5h，12000r/min離心15min，取上清。配置含蛋白50ug電泳樣品，制備厚度為1.0mm的5%聚丙烯酰胺凝膠（pH=6.8），8%分離膠（pH=8.8）。濃縮膠80V電泳0.5h，分離膠103V電泳至溴酚藍燃料前沿至凝膠末端處。取出后4℃、橫流電流250mA轉膜2～3h，常溫封閉90min，隨后加入一抗，4℃過夜孵育，采用TBST洗膜后加入二抗常溫孵育90min。加入ECL reagent顯色液，暗室下膠片曝光、掃描后采用軟件定量分析。

1.3 統計學方法

數據采用SPSS20.0統計軟件進行統計分析，計數資料采用率（%）表示，進行χ2檢驗，計量資料采用（±s）表示，進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2.結果

2.1 Poly I：C對對氧糖剝奪損傷星形膠質細胞TLR3蛋白表達影響

與對照組對比，OGD組和Poly I：C+OGD組星形膠質細胞TLR3表達水平增加（P＜0.01）；OGD組、Poly I：C+OGD各組之間互相對比星形膠質細胞TLR3表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），結果見圖1。

圖1 Western blot檢測Poly I：C對對氧糖剝奪損傷星形膠質細胞TLR3蛋白表達影響

2.2 Poly I：C對對氧糖剝奪損傷星形膠質細胞pIRF3蛋白表達影響

OGD組和Poly I：C+OGD組星形膠質細胞pIRF3表達水平均高于對照組（P＜0.05），Poly I：C+OGD組星形膠質細胞pIRF3表達水平均高于OGD組（P＜0.05），Poly I：C+OGD各組對比星形膠質細胞pIRF3表達水平無差異性（P＞0.05）。結果見圖2。

圖2 Western blot檢測Poly I：C對對氧糖剝奪損傷星形膠質細胞pIRF3蛋白表達影響

2.3 Poly I：C對氧糖剝奪損傷星形膠質細胞pNF-KB蛋白表達影響

OGD組和Poly I：C+OGD組星形膠質細胞pIRF3表達水平均高于對照組（P＜0.05），OGD組、Poly I：C+OGD各組之間互相對比星形膠質細胞TLR3表達水平無差異性（P＞0.05）。結果見圖3。

圖3 Western blot檢測Poly I：C對對氧糖剝奪損傷星形膠質細胞pNF-KB蛋白表達影響

3.討論

大量研究證實，TLR3特異性受體激動劑Ploy I：C在缺血缺氧條件下對神經細胞存在保護作用。如Packard等[9]在小鼠鬧缺血前給予Ploy I：C可有效緩解對神經細胞的損傷。宋璞等給予皮層神經元細胞Ploy I：C處理，結果表明Ploy I：C可有效緩解缺糖缺氧導致的原代神經細胞損傷。Borysiewicz等[10]采用H2O2處理建立缺糖缺氧星形膠質細胞缺氧模型，結果表明Ploy I：C可有效緩解H2O2導致的神經細胞損傷。

本研究結果表明，OGD組和Poly I：C+OGD組TLR3、pNF-KB表達水平均高于對照組（P＜0.05），pIRF3與對照組對比差異無統計學意義（P＞0.05）。Poly I：C+OGD組與OGD組對比，pIRF3蛋白表達水平增加（P＜0.05），pNF-KB表達水平降低（P＜0.05），TLR3表達無差異性（P＞0.05）。

綜上所述，Poly I：C通過促進氧糖剝奪損傷星形膠質細胞pIRF蛋白的表達，進而上調下游抗炎因子干擾素-β的表達相關。